基于混合设计优化的三元单萜配方对植物病原真菌的非加和性抗真菌活性研究

《Scientific Reports》：Simplex-centroid mixture design reveals pathogen-dependent interaction structure in a camphene–d -limonene–eucalyptol system against three phytopathogenic fungi and oomycetes

　　

摘要

合成杀菌剂日益凸显的局限性促使人们更加关注可持续的植物源替代品。本研究采用结合 Scheffé 特殊三次模型的简单重心混合设计，优化了一种三元单萜体系（莰烯、d-柠檬烯、桉叶油素），用于对抗代表不同侵染策略的三种植物病原真菌和卵菌：Macrophomina phaseolina、Phytophthora infestans 和 Verticillium dahliae。十二种制剂（纯化合物、二元混合物和三元混合物）通过肉汤微量稀释法进行测定。单独使用时，这三种单萜是弱抗真菌剂（MIC 150–500 μg/mL）；三元制剂显著降低了 MIC 值，在用于拟合 M. phaseolina 模型的两个设计点上降至 12.5 μg/mL。对于所有三个靶标，拟合模型均具有统计学显著性（R² = 0.8940、0.9604 和 0.9400；R²adj = 0.7668、0.9130 和 0.8680；p = 0.0023–0.0246）。由于众数-MIC 报告惯例会导致纯误差为零，因此无法检验失拟度；模型仅作为所测组成范围内响应面的描述性表示呈现，而非经过外部验证的预测模型。结果显示了依赖于病原菌的相互作用结构：针对 M. phaseolina，二元相互作用占主导地位；针对 P. infestans，三元相互作用占主导地位；针对 V. dahliae，两者均有贡献。这表明抗真菌活性主要由非加和性的混合效应驱动，即显著偏离纯组分的线性混合效应，而非由单一化合物主导。基于合意度（Desirability）的优化方法确定了一种内部配方（莰烯 0.3643、d-柠檬烯 0.2967、桉叶油素 0.3390），其综合合意度为 0.998。由于一旦达到目标，各单项合意度即趋于饱和，因此该组成位于一个更广泛的近似等效混合物范围内，而非唯一的最优解。在该组成下，模型预测 M. phaseolina 的 MIC 值为 16 ± 45 μg/mL，P. infestans 为 41 ± 22 μg/mL，V. dahliae 为 74 ± 11 μg/mL（预测值 ± 预测标准误）。随后在独立于设计运行的条件下制备了该配方，并于不同日期进行了三次生物学重复测定；实验测定的 MIC 值分别为：针对 M. phaseolina 为 15.625 μg/mL（众数），针对 P. infestans 为 50 μg/mL（31.25、50 和 62.5 μg/mL 的中位数），针对 V. dahliae 为 62.5 μg/mL（众数）。所有实测值均在预测值的一个两倍稀释步骤范围内（实测/预测值分别为 1.00、1.22 和 0.85；t(6) = 0.861, p = 0.422；t(6) = 1.166, p = 0.288；t(6) = ?1.841, p = 0.115）。与平行测定的活性最高的纯单萜相比，该优化混合物对 M. phaseolina 的效力提高了 16.0 倍，对 P. infestans 提高了 5.0 倍，对 V. dahliae 提高了 2.4 倍，且三种病原菌对其敏感性存在显著差异（单因素方差分析 F(2,6) = 12.24, p = 0.0076）。总体而言，本研究证明，混合设计驱动的统计优化能够筛选出体外 MIC 值显著低于其单个组分的单萜配方。这些体外结果为未来的温室和田间评价、植物毒性评估及制剂开发提供了定量起点，但本研究未涉及上述内容。