恶性高血压大鼠肾血管病变中明胶酶活性诱导表达的研究

《Scientific Reports》：Gelatinase activity is induced in renal vascular lesions of rats with malignant hypertension

　　

摘要专业翻译 研究人员前期报道了一项RNA测序（RNASeq）分析，比较了恶性2肾1夹（2-kidney-1-clip）高血压与“良性”高血压的肾损伤差异。RNA测序结果提示多种基质金属蛋白酶（matrix metalloproteases，MMPs）存在差异表达。本研究进一步探讨了MMP的表达调控、免疫组织化学特征及明胶酶活性。与假手术对照组（128±9 mmHg）相比，良性高血压大鼠平均血压升高（188±10 mmHg），恶性高血压大鼠平均血压升高更为显著（236±4 mmHg）。与良性高血压相比，恶性高血压中MMP2、MMP7、MMP12、MMP16和MMP19的表达显著升高，唯一例外是MMP9 mRNA表达降低0.2倍。在暴露于高血压的肾脏恶性高血压血管病变中检测到明胶酶活性。明胶酶活性病变数量与MMP2表达相关。假手术组及高血压大鼠左侧（狭窄后）肾脏均未检测到明胶酶活性。MMP2染色见于恶性高血压的血管病变处。MMP9染色见于肾小管、间质细胞及完整血管，但在恶性血管病变中缺失。TIMP1和TIMP2在肾小管细胞中检测到。因此，在恶性高血压中，大多数MMP表达上调。明胶酶MMP2和MMP9呈现显著不同的调控模式，MMP2定位于具有明胶酶活性的恶性血管病变中。

论文解读

一、研究背景与意义

恶性高血压以血压显著升高和多器官进行性终末器官损伤为特征，累及肾脏、脑、血管及眼部等。尽管近几十年来预后有所改善，恶性高血压患者仍处于高风险状态，亟需探索新的治疗策略。在肾脏中，恶性高血压伴随类似血栓性微血管病的血管病理改变，导致肾功能进行性恶化。基质金属蛋白酶（MMPs）是一类锌依赖性酶，因降解细胞外基质蛋白的酶活性而得名，但其作用不仅限于基质降解，还参与炎症调控、上皮细胞可塑性、细胞增殖及血管重塑等多条通路。

研究人员前期通过RNA测序（RNASeq）筛选比较了肾血管性（2K1C）高血压大鼠恶性与非恶性病程的转录组差异，发现除补体级联成分激活外，暴露于高血压的非夹闭肾脏中多种MMP基因表达升高。然而，MMP在恶性高血压特征性肾血管病变中的具体定位及其酶活性尚未明确，不同MMP在恶性与良性高血压中的差异调控也缺乏系统研究。本研究旨在深入探讨MMP的表达调控、组织定位及明胶酶活性，寻找与恶性高血压特征性血管病变共定位的MMP。

二、研究设计与技术方法

研究人员采用2K1C肾血管性高血压大鼠模型，雄性Sprague-Dawley大鼠（150–170 g）接受左肾动脉银夹（内径0.2 mm）置入诱导高血压，对照组行假手术。术后5周根据体重下降和特征性血管病变（洋葱皮样病变和纤维蛋白样坏死）将高血压动物分为恶性组（14只）和良性组（13只），另设假手术对照组（13只）。主要技术方法包括：有创股动脉血压测量；RNA测序分析（数据来自GEO数据库GSE154019，未开展新测序）；实时荧光定量PCR（RT-PCR）验证MMP及TIMP基因表达；免疫组织化学检测MMP2、MMP7、MMP9、TIMP1和TIMP2蛋白定位；原位酶谱法（in situ zymography）检测明胶酶活性；Western blot分析MMP2和MMP9蛋白表达；肾小球硬化评分；另以DOCA盐高血压大鼠模型（6只）进行验证。

三、研究结果

基础参数与肾功能指标： 恶性高血压大鼠相对心室重量和相对右肾重量增加，血清肌酐和尿素在恶性高血压组显著升高，而良性高血压组与假手术组无差异。尿白蛋白和血浆醛固酮在良性高血压中升高，在恶性高血压中显著更高。肾小球硬化评分在良性高血压中增加，在恶性高血压中显著更高。

MMP及TIMP基因表达谱： RNA测序显示恶性高血压肾脏中MMP2、MMP7、MMP8、MMP12、MMP16和MMP19表达升高，MMP9显著降低，MMP15不变；TIMP1和TIMP2诱导升高，TIMP3和TIMP4不受影响。RT-PCR验证了MMP2、MMP7、MMP12、MMP16、MMP19及TIMP1、TIMP2在恶性高血压中显著高于假手术组和良性高血压组；MMP8部分低于检测限未进一步研究；MMP9在恶性高血压中表达降低；MMP15、TIMP3和TIMP4在各组间无差异。

MMP2蛋白定位与表达： 免疫组织化学显示MMP2在部分肾小管细胞阳性，主要见于血管病变处。Western blot证实恶性高血压肾组织中MMP2蛋白表达显著。MMP7在血管及浸润细胞中检测到。MMP9在肾小管及部分浸润细胞中检测到。TIMP1和TIMP2主要在肾小管细胞中表达。计数分析显示恶性高血压大鼠肾脏中MMP9阳性肾小管横断面较对照组或良性高血压未增加，而TIMP1和TIMP2阳性肾小管横断面在恶性高血压中增加。

明胶酶活性定位与相关性： 原位酶谱法检测到明胶酶活性主要位于恶性高血压的血管病变中。MMP2免疫染色与原位酶谱法呈现非常相似的模式，两者均见于血管病变和间质病变。计数显示恶性高血压大鼠组织受累最显著。明胶酶活性与MMP2表达、MMP2阳性病变数量及肾小球硬化评分均呈显著相关。在另一恶性高血压模型（DOCA盐高血压）中，受损肾小球和血管病变中也同时检测到MMP2染色和明胶酶活性。

四、讨论与结论

本研究核心发现是MMP2免疫反应性定位于恶性高血压大鼠暴露于高血压肾脏的洋葱皮样血管病变中，而狭窄后肾脏、正常血压对照组及良性高血压大鼠肾脏中均无此现象。MMP2免疫反应性与血管病变中明胶酶活性相关，提示MMP2可能参与恶性高血压特征性血管病变的形成。

关于TIMP的调控，TIMP1和TIMP2在恶性高血压肾脏中显著上调，但定位于肾小管而非血管损伤部位，提示TIMP1或TIMP2不太可能在血管病变处限制MMP2活性。MMP7在恶性高血压中mRNA上调幅度超过MMP2，但未定位于血管损伤部位，其在假手术或良性高血压大鼠小动脉中膜有免疫染色，而在恶性高血压受损血管中趋于消失。MMP9的调控与其他MMP显著不同，转录水平在恶性高血压中趋于下降而非升高；免疫组织化学显示其在假手术和良性高血压大鼠肾小管中丰富，在恶性高血压中肾小管染色保留，但在纤维化或血管损伤区域趋于丢失，仅见于个别细胞（可能为浸润巨噬细胞），其确切作用仍不明确。

研究局限性包括：未通过特异性抑制剂在体内直接验证单个MMP的作用；仅研究了肾血管性高血压诱导后的单一时间点；恶性与非恶性高血压的分类标准可能具有一定主观性，但前期RNASeq分析显示两者之间存在广泛的转录差异，使用远交系大鼠品系带来的个体遗传变异可能部分解释了血管损伤易感性的差异；血清肌酐和尿素未显示良性高血压大鼠肾损伤，可能与高血压持续时间较短、参数在啮齿动物中敏感性较低及选择偏倚有关。

研究结论：恶性高血压大鼠中多种MMP及其部分抑制剂显著调控。MMP2可能参与该型高血压最严重血管病变的形成，未来需要特异性抑制剂的体内研究加以验证。