《Scientific Reports》：Identification of NUDT6 and LINGO1 as candidate genes for nCRT-associated signatures to neoadjuvant chemoradiotherapy in rectal cancer patients
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直肠癌是全球高发癌症，也是癌症死亡的常见原因。新辅助放化疗（nCRT）是晚期直肠癌的首选治疗方式。在本研究中，研究人员采用生物信息学方法探索直肠癌中受nCRT影响的候选基因。共收集26例直肠癌患者样本，分为治疗组（接受nCRT的14例患者）和对照组（未接受nC
直肠癌是全球高发癌症，也是癌症死亡的常见原因。新辅助放化疗（nCRT）是晚期直肠癌的首选治疗方式。在本研究中，研究人员采用生物信息学方法探索直肠癌中受nCRT影响的候选基因。共收集26例直肠癌患者样本，分为治疗组（接受nCRT的14例患者）和对照组（未接受nCRT的12例患者）。通过高通量测序、差异表达分析、机器学习算法、受试者工作特征（ROC）曲线和基因表达分析筛选候选基因。采用基因集富集分析（GSEA）追踪这些候选基因的富集通路。此外，还探讨了免疫细胞与这些候选基因之间的关系。基于所选候选基因构建了列线图和分子调控网络。所有样本的测序数据质量均较高。共发现35个差异表达基因（DEGs）。其中，NUDT6和LINGO1被鉴定为具有高区分能力的候选基因（两者的曲线下面积（AUC）均>0.8）。构建了具有满意探索性能的列线图。NUDT6显著富集于核糖体和氧化磷酸化通路，并与巨核-红系祖细胞（MEP）和辅助性T细胞1（Th1细胞）显著正相关，与肌细胞显著负相关。LINGO1显著富集于蛋白酶体通路，并与红细胞显著正相关。此外，药物预测分析表明，丙戊酸与NUDT6的关联性最高，而双酚A与LINGO1的关联最密切。在本研究中，与对照组（未接受nCRT的患者）相比，NUDT6和LINGO1被鉴定为与治疗组（接受nCRT的患者）显著相关的潜在候选基因。这些发现可能为直肠癌nCRT治疗的分子相关性提供探索性见解。此外，由于本研究依赖单中心便利样本，这些发现需要在多中心前瞻性队列中进一步验证。
直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，在全球范围内具有高发病率和死亡率。局部晚期直肠腺癌（READ）约占结直肠癌（CRC）病例的30%，其标准治疗方案包括新辅助放化疗（nCRT）。尽管多学科综合治疗已将局部复发率降至5%–9%，但患者对nCRT的反应存在显著个体差异，病理完全缓解（pCR）率仅为15%–20%，且缺乏能够准确预测疗效的分子生物标志物，导致过度治疗或治疗不足。因此，亟需通过数据驱动策略挖掘与nCRT相关的核心基因，为精准治疗提供依据。
研究人员从四川省人民医院连续纳入26例直肠癌患者肿瘤组织样本，其中治疗组14例接受nCRT，对照组12例未接受nCRT。通过高通量转录组测序、差异表达分析、五种机器学习算法（LASSO、SVM-RFE、Boruta、XGBoost、随机森林）取交集、ROC曲线评估、GSEA通路富集、xCell免疫浸润分析、调控网络构建及列线图建立，系统筛选并验证了与nCRT相关的候选基因。结果鉴定出NUDT6和LINGO1两个核心特征基因，二者在治疗组中均显著下调（P<0.05），且AUC均>0.8，提示具有良好的区分能力。GSEA显示NUDT6富集于核糖体和氧化磷酸化通路，LINGO1富集于蛋白酶体通路；免疫浸润分析显示两者与多种免疫细胞显著相关。外部验证中，单独基因表现有限，但联合列线图模型展现出一定的预测可行性。这些发现为理解nCRT的分子机制和开发预测标志物提供了探索性基础。
关键方法方面，样本来源于四川省人民医院，共26例直肠癌肿瘤组织（治疗组n=14，对照组n=12）。主要技术包括：Illumina NovaSeq 6000平台进行RNA测序（PE150，每样本≥6 GB）；DESeq2筛选差异表达基因（筛选标准为校正后P<0.05且|log
2(Fold Change)|>0.5）；五种机器学习算法（LASSO、SVM-RFE、Boruta、XGBoost、随机森林）取交集确定特征基因；pROC包绘制ROC曲线评估诊断效能；clusterProfiler进行GSEA富集分析；xCell算法计算64种免疫细胞浸润分数；CTD数据库预测靶向药物；miRTarBase和miRWalk数据库预测miRNA并构建lncRNA-miRNA-mRNA网络；rms包构建列线图，并用校准曲线和决策曲线分析（DCA）评估。
测序数据可靠性与质量评估：所有样本的Q20值均高于99.71%，Q30值超过97.58%，样本间Pearson相关系数大于0.6，表明测序数据质量高、组内重复性好，满足后续分析要求。
DEGs的鉴定及初步GO分析：通过DESeq2共鉴定出35个DEGs，其中11个上调、24个下调；GO富集分析显示这些基因涉及磷脂酰胆碱代谢、轴突包裹等生物学过程；蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络包含25个蛋白质和28个相互作用对，为后续特征筛选提供了候选池。
五种机器学习算法鉴定NUDT6和LINGO1：LASSO筛选出6个基因，SVM-RFE筛选出14个，Boruta筛选出14个，XGBoost筛选出6个，随机森林筛选出10个；取五者交集后，最终确定NUDT6和LINGO1作为与nCRT相关的特征基因。
诊断效能和表达水平验证：ROC曲线显示NUDT6和LINGO1的AUC均>0.8，能有效区分治疗组与对照组；Wilcoxon秩和检验证实两者在治疗组中显著下调（P<0.05）；校正年龄和距肛门距离后，差异仍具有统计学意义，提示其作为候选基因具有稳健性。
生物学通路和免疫景观解析：GSEA显示NUDT6显著富集于核糖体、氧化磷酸化等84条KEGG通路；LINGO1显著富集于蛋白酶体、细胞周期等86条KEGG通路。免疫浸润分析显示，治疗组的红细胞、巨核-红系祖细胞（MEP）和Th1细胞显著低于对照组，而肌细胞显著高于对照组；相关性分析表明NUDT6与MEP和Th1细胞显著正相关（R=0.50，P<0.05），与肌细胞显著负相关（R=-0.55，P<0.05）；LINGO1与红细胞显著正相关（R=0.63，P<0.01）。
独立队列外部验证：在GSE190826队列（n=117）中，NUDT6和LINGO1在pCR与非pCR组间无显著差异，单一基因AUC<0.7；但两者联合的列线图模型在校准曲线和DCA中表现出较好的一致性和临床净获益，提示多基因组合可能具有更稳定的预测能力。
调控网络和临床预测模型构建：预测了LINGO1的3个靶向miRNA和38个靶向lncRNA，构建了包含3个miRNA、1个mRNA和38个lncRNA的调控网络；CTD药物预测显示，丙戊酸与NUDT6关联最强，双酚A与LINGO1关联最强；基于NUDT6和LINGO1两基因的列线图在训练集中表现出良好的校准和临床决策获益。
讨论部分总结：研究人员指出，NUDT6作为FGF2反义基因，可能通过核糖体和氧化磷酸化通路参与蛋白质合成和代谢适应，并与Th1细胞正相关，提示其可能参与抗肿瘤免疫调节。LINGO1传统上被视为神经相关跨膜蛋白，但研究发现其富集于蛋白酶体通路，且可能通过调节BK通道影响钙稳态和DNA损伤反应，其与红细胞的正相关可能反映肿瘤微环境的氧合状态。研究人员同时强调，药物预测结果基于计算数据库，需谨慎解读，双酚A作为环境内分泌干扰物具有潜在毒性。局限性方面，样本量小、单中心便利抽样、横断面设计可能限制因果推断，外部验证中单基因表现不稳定，但联合模型具有一定可靠性。未来需多中心前瞻性队列和功能实验验证。
研究结论：本研究通过转录组分析和临床适用的列线图，初步将NUDT6和LINGO1确定为与直肠癌nCRT治疗相关的潜在候选基因。这些发现提示这些基因与关键信号通路及免疫调节存在相关性，为未来精准治疗策略的发展提供了探索性见解。
