《Scientific Reports》：Reference intervals for neutrophil reactive oxygen species production capacity in Japanese adults
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固有免疫是对病原体的第一道防线，但评估其功能的定量基准仍十分有限。研究人员开发了光学传感系统，只需将3 μL全血稀释至反应混合物中即可实时测量中性粒细胞活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生。本研究利用这些光学平台，以40–60
固有免疫是对病原体的第一道防线，但评估其功能的定量基准仍十分有限。研究人员开发了光学传感系统，只需将3 μL全血稀释至反应混合物中即可实时测量中性粒细胞活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生。本研究利用这些光学平台，以40–60岁为主的健康日本成人为对象，估算循环中性粒细胞固有免疫反应的参考区间。在化学刺激后，同时测量中性粒细胞超氧阴离子（O2•?）产生和次氯酸（HOCl）产生，后者反映髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）活性。数据来自329名经严格筛选的个体，这些个体选自2020年2月至2025年3月接受全面健康检查的7,263名受试者（主要为日本人）。研究计算了六项中性粒细胞活性指标的参考区间，包括总ROS产生、单位中性粒细胞ROS产生、两种ROS之间的平衡以及中性粒细胞对刺激的反应性；另评估了使用简化光学系统获得的两项相应次氯酸相关指标。虽然中性粒细胞活性指标是否存在性别差异仍不明确，但研究人员对存在统计学显著性别差异的指标计算了性别特异性参考区间，并从未来研究角度讨论了观察到的差异。研究人员进一步考察了各指标间的相互关系及其与年龄和常规炎症标志物的关联。这些发现提供了检测方法特异性的固有免疫定量评估框架，并可能支持未来关于亚临床免疫变异的研究。当前实验室检测与更广泛临床应用之间的差距以及未来挑战也在文中加以讨论。
研究背景与问题
固有免疫被视为机体抵御病原体的第一道防线，但建立免疫功能的定量基准仍是基础免疫学和临床医学面临的难题。中性粒细胞是固有免疫的核心效应细胞，既参与病原清除，也可促进炎症病理。仅凭循环中性粒细胞数量无法推断其功能状态，因为细胞活化、代谢和免疫可塑性等复杂过程均会影响效应程序。传统功能检测多需先分离中性粒细胞，操作技术要求高，且可能引入人为激活或损伤，难以用于大规模人群和常规临床评估。因此，研究人员开发了基于微量全血的光学检测平台，并以此开展人群水平的参考区间研究。
研究人员从2020年2月至2025年3月在滨松医学影像中心接受综合癌症筛查的7,263人次（3,996名个体）中，通过严格排除标准筛选出329名健康日本成人参考个体（男性181名，女性148名），年龄以40–60岁为主。排除条件包括自报疾病或用药、影像学提示活动性或亚临床病变、异常FDG摄取、血管钙化、内脏脂肪面积≥100 cm
2、新冠疫苗接种史、当前吸烟等，并仅采用首次就诊数据，以减少炎症混杂和重复测量影响。
主要技术方法：研究人员使用自行开发的CFL-H3200同时化学发光/荧光测量系统和FLP-H4200专用荧光系统，取3 μL肝素抗凝全血加入反应缓冲液，以佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA）刺激并实时记录1,500 s；超氧阴离子（O
2•?）由MCLA化学发光检测，次氯酸根（OCl
?）由APF荧光检测，后者反映髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）活性。不同仪器间的荧光次氯酸根信号（FL-OCl
?）以校正系数统一。参考区间按Tango方法将分布转换至正态后，以第2.5至97.5百分位估计，并计算90%置信区间；年龄相关参考限采用非参数方差稳定化变换估计。样本队列来自滨松医学影像中心综合癌症筛查参与者。
研究结果
1. 参考人群筛选：从7,263人次中筛选出329名健康参考个体。参考人群与全体受试者相比具有更有利的身体状况，并降低了炎症干扰因素影响。
2. 中性粒细胞活性指标：研究人员定义并分析了8项指标。CL-O
2•?代表单位时间O
2•?产生量；FL-OCl
?代表单位时间OCl
?产生量，即MPO活性；CL-O
2•?/Unit Neu和FL-OCl
?/Unit Neu分别按3 μL全血中的中性粒细胞数（Unit Neu，1×10
3 cells）归一化；FL-OCl
?/CL-O
2•?反映下游与上游ROS生成的平衡；CL-O
2•? RP为PMA刺激至化学发光信号上升点的时间，反映中性粒细胞对刺激的反应性。FL-OCl
?_FLP和FL-OCl
?_FLP/Unit Neu来自简化荧光系统，分别等价于FL-OCl
?和FL-OCl
?/Unit Neu。
3. 参考区间设定：在329名参考个体中，FL-OCl
?/Unit Neu、CL-O
2•? RP和FL-OCl
?_FLP/Unit Neu存在统计学性别差异，因此另计算了性别特异性参考区间；其余指标采用男女性合并参考区间。CL-O
2•?参考区间与中期报告一致；FL-OCl
?和FL-OCl
?_FLP的参考限因校正系数上调约2.5倍而相应升高。男性在单位中性粒细胞OCl
?产生相关指标上较高，且CL-O
2•? RP较短。年龄相关模式并不一致，部分指标在女性中约50岁前下降、其后升高，但可能受年龄组抽样异质性影响。
4. 指标间相关性：FL-OCl
?与FL-OCl
?_FLP呈强正相关（R=0.925），说明两种系统测量同一生物学参数。CL-O
2•?与FL-OCl
?仅弱正相关，提示二者捕捉中性粒细胞功能的不同维度；总产生指标与单位中性粒细胞指标呈中等程度正相关；ROS产生量与CL-O
2•? RP呈弱负相关，表明产生量较大时激活潜伏期较短，但相关性弱，提示各指标具有相对独立的意义。这些相关模式在参考队列和全体受试者中相似。
5. 与常规炎症标志物的相关性：CL-O
2•?和FL-OCl
?与中性粒细胞计数（Neu#）呈正相关，但程度中等，说明这些指标包含中性粒细胞数量以外的功能信息；二者也与中性粒细胞/淋巴细胞比值（neutrophil-to-lymphocyte ratio, NLR）呈正相关。未观察到C反应蛋白（C-reactive protein, CRP）等其他炎症标志物与中性粒细胞活性指标的明确关联。
讨论与结论
讨论指出，本研究纳入标准比中期分析更严格，并将指标框架扩展至单位细胞产生效率、ROS种类平衡和刺激反应潜伏期。由于中性粒细胞活性指标是否存在性别差异仍不明确，未来建议优先使用男女性合并参考区间，同时深入研究性别差异机制。年龄调整参考区间的必要性同样有待验证。研究局限主要包括：参考人群以40–60岁日本人为主，缺乏年轻群体和非日本裔人群；各指标尤其是ROS平衡和反应潜伏期的分子机制仍不明确；检测系统需多中心验证、绝对激发光强度标准化以及遵循临床检验标准；统计上仅使用一种参考区间估计方法，未来应比较多种方法并报告Bootstrap置信区间。研究人员强调，当前实验室检测与常规临床应用之间仍有差距，需开展个体内生物学变异、精密度、稳定性和批次间差异等验证。
研究结论：本研究在经严格筛选的日本成人参考队列中，利用微量全血光学平台建立了PMA刺激下中性粒细胞ROS产生指标的检测方法特异性参考区间。这些参考区间为未来研究这些指标与宿主防御、炎症及免疫失调相关的临床意义提供了定量技术基础。
