摘要
巨自噬/自噬通过将细胞质物质输送到溶酶体进行降解来维持细胞稳态。自噬体的形成需要大量的磷脂供应，这一过程主要由脂质翻转酶ATG9A以及脂质转运蛋白ATG2A和ATG2B支撑。我们最近的研究表明，这些蛋白质的缺失也会改变小 extracellular vesicle（sEV）的分泌及其成分。缺乏ATG9A或ATG2A/B的细胞在溶酶体抑制过程中会释放更多的sEV，但这些囊泡中微管相关蛋白1A/1B轻链3（LC3）和典型的自噬货物受体的含量较少。这些变化伴随着amphisome形成的障碍以及细胞脂质组的广泛重构。我们的发现表明，ATG9A和ATG2A/B协调自噬与内吞分泌之间的膜和货物分配，这提示溶酶体脂质供应的紊乱可能导致脂质转向extracellular vesicle（EV）的生成。
免责声明
作为对作者和研究人员的服务，我们提供了这篇已接受的手稿（AM）版本。在最终发表的版本（VoR）之前，将对该手稿进行Copyediting、排版和审稿。在制作和预印过程中可能会发现影响内容的问题，所有适用于期刊的法律免责声明也适用于这些版本。正文
自噬与内吞系统有广泛的交集。自噬体可以与多囊泡内吞体（MVEs）融合，形成称为amphisomes的混合细胞器。这些amphisomes可以与溶酶体融合，或者在溶酶体抑制期间参与自噬相关物质的细胞外释放。这一过程称为溶酶体抑制期间的分泌性自噬（SALI），是一种需要自噬体生物发生的amphisomal分泌性自噬形式。我们的研究[1]探讨了自噬体形成所需的脂质处理蛋白如何影响amphisome的形成和EV的分泌。
我们比较了缺乏ATG9A或ATG2A和ATG2B的HeLa细胞与野生型（WT）细胞以及缺乏ATG7（LC3结合所必需的蛋白质）的细胞之间的EV分泌情况。这种比较有助于区分上游脂质供应的紊乱与下游自噬功能的丧失。ATG2A/B缺陷细胞在基础条件下会释放更多的sEV，而在bafilomycin A1抑制溶酶体时，ATG9A或ATG2A/B的缺失显著增加了sEV的分泌。相比之下，尽管LC3的脂质化和货物输出发生了变化，但ATG7缺陷细胞的总体sEV输出与WT细胞相似。自噬起始蛋白RB1诱导的卷曲螺旋1（RB1CC1，简称FIP200）的缺失也损害了自噬，但并未导致这种过度分泌的现象。冷冻电子显微镜观察到ATG9A和ATG2A/B缺陷细胞产生的sEV较小，而透射电子显微镜显示MVEs内积累了更小的内腔囊泡（ILVs），尤其是在溶酶体抑制后。分泌的sEV富含CD63，这是一种外泌体标记蛋白和脂质分选蛋白，尤其是在ATG2A/B缺失和溶酶体抑制期间。活细胞成像和RAB27A的耗尽进一步支持了依赖MVE的分泌增加。这些观察结果将ATG9A和ATG2A/B的缺失与内吞膜组织和EV输出的改变联系起来。
这种增加的分泌是否代表SALI的增强？尽管ATG9A和ATG2A/B缺陷细胞释放了更多的sEV，但在溶酶体抑制期间，它们释放的细胞外LC3B-II的含量比WT细胞少。sEV富集 fraction中的残留LC3B-II并未因氯喹处理或表达
对自噬缺陷细胞中sEV富集 fraction的蛋白质组学分析显示，典型的自噬货物受体和铁蛋白吞噬相关蛋白的水平较低，但参与RNA装载和内吞运输的蛋白水平较高。因此，囊泡释放的增加并没有补偿缺陷的自噬相关货物输出，而是改变了到达细胞外空间的细胞成分。这些变化表明，循环中的EV相关货物谱型可能作为细胞内自噬缺陷的生物标志物，尽管其特异性和来源组织仍需验证。
在描述了sEV分泌和成分的变化后，我们进一步探讨了为什么向自噬体供应脂质的蛋白质缺失会增加内吞分泌。全细胞脂质组学分析显示，ATG9A和ATG2A/B缺陷细胞中的鞘脂和磷脂发生了广泛变化，同时积累了神经酰胺和中性脂质。这些变化伴随着脂滴的增加以及脂质代谢酶的转录重编程。用GW4869抑制中性鞘氨醇酶使升高的sEV输出恢复正常，这支持了鞘脂代谢对这一表型的贡献。虽然全细胞脂质测量无法确定这些脂质在细胞器间的具体积累位置和移动方式，但将脂质从自噬体形成转向内吞途径的假设模型仍然是一个可行的解释（见的概述）。
图1： ATG9A–ATG2A/B协调脂质稳态和细胞外囊泡分泌。ATG9A敲除或ATG2A/B双敲除会损害自噬体/amphisome的形成（红色交叉圆圈；淡色的细胞器）。神经酰胺的积累和脂滴的增加伴随着较小的、富含CD63的sEV的RAB27A依赖性分泌，以及溶酶体抑制期间自噬相关货物输出的减少。蓝色箭头表示运输和脂质转化；紫色箭头表示脂质/囊泡通量的增加。绿色阴影突出了脂质紊乱和amphisome形成的障碍。红色膜符号代表CD63；向上的箭头表示丰度增加。红色条表示BafA1介导的溶酶体抑制。内质网脂质过载和重定向仍属于假设。缩写：ATG，自噬相关；BafA1，bafilomycin A1；Cer，神经酰胺；EE，早期内吞体；ER，内质网；ILVs，内腔囊泡；LDs，脂滴；LC3B-II，脂质化微管相关蛋白1轻链3 beta；MVEs，多囊泡内吞体；PM，质膜；RE，回收内吞体；sEVs，小细胞外囊泡；SM，鞘氨醇。示意图由Singh, A. (2026) 在BioRender (
) 创建，并在Adobe Illustrator中修改。
总体而言，我们的观察结果扩展了已知的SALI过程中自噬体生物发生的必要性，将脂质处理ATG蛋白的紊乱与囊泡输出的增加联系起来，尽管自噬相关货物输出受到限制。它们确立了ATG9A–ATG2A/B脂质转运轴作为细胞脂质稳态的重要调节因子，并表明随着细胞适应脂质平衡的变化，EV分泌也会发生重组。一个有趣的可能性是，这种以脂质为中心的模型不仅适用于自噬和EV：脂质分布的改变可能有助于解释之前报道的线粒体呼吸缺陷、其他细胞器的运输障碍（包括神经元突触囊泡）以及这些敲除细胞中的质膜修复缺陷。未来的研究应确定通常 destinée 给自噬体的脂质是否会在内质网（ER）中积累并重新定向到内吞体或脂滴。相反，操纵内吞体上的这些脂质可能揭示LC3阳性膜与MVEs融合的过程如何受到影响，以及这一过程在功能上的重要性，例如在铁死亡（ferroptosis）期间，鉴于铁蛋白吞噬相关蛋白的细胞外丰度发生了变化。代谢追踪和细胞器分辨的脂质组学可以澄清脂质从ER到自噬体、MVEs、ILVs和分泌EV的移动。最终，这些方法应确定自噬和EV生物发生是否竞争相同的脂质池，以及细胞在自噬和溶酶体压力下如何重新分配膜和货物。
作者贡献
A.S. 制作了图表并起草了手稿，而两位作者共同撰写和编辑了最终文本和图表。C.M.G 为这项研究提供了资金支持。
作者声明没有利益冲突。
使用ChatGPT/OpenAI来检查和改进初稿的语言。最终文档由作者进行了严格评估，他们对最终发表文章的内容负全责。
披露声明
数据可用性声明
本评论未生成新的数据。所有支持原始发现的数据均可见于[1]。
