《Antioxidants》：Repurposing Marine Waste into Functional Antioxidants: Boiled Tuna Skin Enzyme Hydrolysate Mitigates AAPH-Induced Oxidative Stress and Apoptotic DNA Damage Across In Vitro and In Vivo Models
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海产加工产业每年产生大量固体废弃物，其中煮制金枪鱼皮是主要的低商业价值副产物之一。本研究评估了源自煮制鲣鱼（Katsuwonus pelamis）皮副产物的风味蛋白酶（Flavourzyme）水解物（BTSFH）的抗氧化活性，及其在体外（In Vitro）与体
海产加工产业每年产生大量固体废弃物，其中煮制金枪鱼皮是主要的低商业价值副产物之一。本研究评估了源自煮制鲣鱼（Katsuwonus pelamis）皮副产物的风味蛋白酶（Flavourzyme）水解物（BTSFH）的抗氧化活性，及其在体外（In Vitro）与体内（In Vivo）模型中缓解2,2′-偶氮二（2-脒基丙烷）二盐酸盐（AAPH）诱导的氧化应激的能力。研究人员通过风味蛋白酶在pH 7.0条件下进行酶解，改善了产物的功能特性，制备出具有抗氧化活性的水解物。采用过氧化氢（H2O2）清除活性与ABTS自由基清除活性评估BTSFH的抗氧化能力，其IC50值分别为2.91 mg/mL和7.52 mg/mL。BTSFH处理可提高细胞活力，显著降低AAPH诱导的氧化应激下活性氧（ROS）的产生，并保护细胞免受AAPH诱导的凋亡性DNA损伤。BTSFH通过上调AAPH刺激的Vero细胞中内源性抗氧化酶（超氧化物歧化酶SOD和过氧化氢酶Catalase）的表达，表现出强效抗氧化活性。体内斑马鱼（zebrafish）实验进一步证实了其抗氧化潜力，表现为减少ROS生成、脂质过氧化和细胞死亡，从而支持其作为生物活性化合物的应用前景。上述体外与体内研究结果表明，BTSFH样品表现出强抗氧化活性，为其在药品和保健补充剂中的应用提供了初步证据。海洋副产物作为功能性成分来源，有助于减少废弃物并促进资源管理优化，符合可持续循环生物经济（circular bioeconomy）的宏观目标。
一、研究背景与问题
全球海产食品加工产业每年产生大量副产物，包括骨骼、鱼头、内脏、鳞片和鱼皮等，约占原料总重量的60%–70%。金枪鱼加工过程中产生大量煮制金枪鱼皮，这是一种低价值副产物。随着全球对可持续资源利用和零废弃加工的需求日益增长，通过酶解将这些副产物转化为高价值生物活性化合物已成为研究热点。鲣鱼（Katsuwonus pelamis）是全球罐装和加工金枪鱼市场中数量最丰富、商业价值最高的金枪鱼种类之一，其加工过程中产生大量鱼皮副产物。金枪鱼皮富含胶原蛋白、蛋白质、脂质和生物活性肽。食品来源的抗氧化剂作为合成抗氧化剂（如丁基羟基甲苯BHT和丁基羟基茴香醚BHA，二者存在毒理学隐患）的更安全替代品，已引起广泛研究关注。海洋生物活性肽具有强抗氧化特性、结构多样性和低毒性。然而，目前仅有少量研究探讨了风味蛋白酶辅助水解煮制金枪鱼皮（BTSFH）的抗氧化活性及其作用机制。因此，研究人员开展本研究，旨在利用体外细胞信号分析和体内模型系统，探究BTSFH的潜在抗氧化特性及其内在机制，为海产副产物的高值化利用提供科学依据。
二、研究内容与结论
研究人员以煮制鲣鱼皮为原料，采用风味蛋白酶（Flavourzyme，来源于米曲霉Aspergillus oryzae，兼具外肽酶和内肽酶活性）在pH 7.0、50 °C条件下酶解24小时制备BTSFH，系统评估了其化学抗氧化活性、体外细胞保护作用及体内斑马鱼模型的抗氧化功效。研究得出以下主要结论：BTSFH具有显著的化学抗氧化活性，其H2O2清除活性（IC50 = 2.91 mg/mL）优于ABTS自由基清除活性（IC50 = 7.52 mg/mL）；BTSFH可提高AAPH诱导氧化应激下Vero细胞的存活率，显著降低细胞内ROS水平，并通过上调SOD和过氧化氢酶（Catalase）蛋白表达增强内源性抗氧化防御系统；BTSFH可浓度依赖性地抑制AAPH诱导的细胞凋亡性核形态变化；在斑马鱼体内模型中，BTSFH有效降低ROS生成、脂质过氧化和细胞死亡，其效果与阳性对照地塞米松（Dexamethasone）相当或略优。该研究证实了煮制金枪鱼皮副产物经风味蛋白酶水解后可作为功能性抗氧化成分，为海产副产物的资源化利用和循环生物经济发展提供了初步证据，支持其在药品和保健补充剂领域的应用潜力。
三、主要关键技术方法
研究人员采用的主要技术方法包括：风味蛋白酶辅助酶解制备水解物（以韩国东远产业株式会社提供的煮制鲣鱼皮为原料）；ABTS自由基清除和H2O2清除化学抗氧化活性测定；氨基酸自动分析仪（Biochrom 30+）进行游离氨基酸和总氨基酸组成分析；Vero细胞（购自美国典型培养物保藏中心ATCC）模型结合MTT法评估细胞活力、DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平、Western blot分析SOD和过氧化氢酶蛋白表达、Hoechst 33342染色观察凋亡性核形态变化；斑马鱼（Danio rerio）体内模型（胚胎购自韩国首尔水族馆，动物实验经济州大学动物护理与使用委员会批准，批准号2020-0049），采用DCF-DA、吖啶橙（acridine orange）和DPPP荧光染色分别检测ROS生成、细胞死亡和脂质过氧化。
四、研究结果
4.1 化学抗氧化活性：通过ABTS自由基清除和H2O2清除两种化学分析方法评估BTSFH的抗氧化能力。结果显示，ABTS自由基清除活性在1.25–10 mg/mL浓度范围内呈浓度依赖性增加，IC50值为7.52 mg/mL；H2O2清除活性在0.625–5 mg/mL范围内呈强浓度依赖性响应，IC50值为2.91 mg/mL。两种化学分析比较表明，BTSFH对H2O2的清除活性更强，提示其具有显著的抗氧化潜力。
4.2 水解物组成、游离氨基酸含量和总氨基酸组成：BTSFH中共分析出38种氨基酸及相关化合物。游离氨基酸中，L-赖氨酸含量最高（占总游离氨基酸的9.89%），其次为L-谷氨酸（8.86%）、L-天冬酰胺（8.64%）、L-酪氨酸（8.33%）、L-精氨酸（7.96%）和L-缬氨酸（6.35%）。总氨基酸组成中，谷氨酸和甘氨酸含量最高（分别为12.8%和11.39%），天冬氨酸（9.06%）、亮氨酸（7.42%）、丙氨酸（7.08%）含量较高；必需氨基酸总占比为42.16%，其中亮氨酸和缬氨酸含量相对较高，表明BTSFH可作为良好的必需氨基酸来源。
4.3 BTSFH预防AAPH诱导的细胞内ROS产生和氧化性细胞死亡：MTT细胞毒性实验显示，400 μg/mL浓度的BTSFH对Vero细胞具有毒性，后续研究采用低于200 μg/mL的浓度。AAPH（10 mM）单独处理显著降低细胞活力，而BTSFH预处理可提高细胞存活率。DCFH-DA检测表明，AAPH处理组ROS水平显著升高，BTSFH处理可浓度依赖性地降低ROS产生，证明BTSFH在体外可缓解AAPH诱导的氧化应激损伤。
4.4 BTSFH对氧化蛋白表达的调控：Western blot分析显示，AAPH处理组Vero细胞中SOD和过氧化氢酶蛋白表达较对照组显著降低，而BTSFH处理可浓度依赖性地恢复并上调这两种内源性抗氧化酶的表达，表明BTSFH通过增强细胞抗氧化防御系统来对抗AAPH诱导的氧化应激。
4.5 BTSFH对凋亡形态学变化的影响：Hoechst 33342荧光染色显示，对照组细胞核形态正常，无凋亡细胞；AAPH（10 mM）处理组出现显著的核浓缩和凋亡小体形成，表明严重氧化应激诱导的细胞凋亡；BTSFH在25–200 μg/mL浓度范围内可浓度依赖性地减少凋亡小体数量，证明BTSFH能有效保护细胞免受AAPH诱导的核损伤。
4.6 BTSFH的体内抗氧化活性：斑马鱼模型实验表明，BTSFH浓度高于50 μg/mL时显著降低存活率并增加心率。AAPH（15 mM）处理显著增加DCF-DA、吖啶橙和DPPP的荧光强度，表明氧化应激、细胞凋亡和脂质过氧化水平升高。BTSFH处理可浓度依赖性地降低ROS生成、细胞死亡和脂质过氧化，其中50 μg/mL浓度处理组的ROS抑制效果优于对照组，地塞米松阳性对照的ROS降低效果最强（降至基础水平约0.5倍）。在脂质过氧化抑制方面，BTSFH效果与地塞米松（50 μM）相当或略优。
五、讨论与结论
讨论部分指出，BTSFH的抗氧化活性与其氨基酸组成密切相关：酪氨酸等芳香族氨基酸通过酚羟基结构发挥电子或氢供体作用；含硫氨基酸（蛋氨酸、胱氨酸）易自身氧化而保护其他细胞成分；谷氨酸是谷胱甘肽（GSH）生物合成的重要前体；甘氨酸参与GSH合成的限速步骤并可上调SOD、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等保护性酶；疏水性氨基酸（缬氨酸、亮氨酸等）通过增强肽与脂质自由基的相互作用发挥抗氧化作用。BTSFH通过清除自由基、降低ROS水平、上调内源性抗氧化酶表达，从而减少下游脂质损伤并预防细胞凋亡。该研究的局限性在于未测定肽的分子量分布，未鉴定单一活性肽序列，未来研究需通过LC-MS/MS分离鉴定活性肽、评估口服生物利用度、稳定性、感官特性和规模化生产可行性。
研究结论：本研究结果表明，煮制金枪鱼皮作为罐头加工副产物，在热处理后仍是可行的蛋白质来源，通过风味蛋白酶辅助水解可制备抗氧化水解物BTSFH，其主要由肽结合氨基酸组成。BTSFH在体外和体内均能保护机体免受AAPH诱导的氧化应激损伤，主要通过限制ROS积累及其导致的细胞死亡和过氧化来实现。这些发现仅适用于粗水解物，活性肽及其作用机制尚未明确。BTSFH作为抗氧化成分，在工业应用前需进一步评估。未来研究应通过LC-MS/MS分离鉴定活性肽，评估其口服生物利用度、稳定性、感官特性及在食品和保健补充剂中的规模化应用可行性。
