妊娠中期补充褪黑素通过调控抗氧化能力改善宫内发育迟缓仔猪肝脏纤维化

《Antioxidants》：Supplementation of Melatonin During the Second Trimester Improves Liver Fibrosis in Piglets with Intrauterine Growth Restriction by Regulating Antioxidant Capacity

宫内发育迟缓（IUGR）常导致胎儿肝脏发育异常及远期肝脏代谢性疾病风险升高。本研究以初产长白×大白母猪为模型，探讨妊娠中期（第60–90天）补充褪黑素对IUGR胎猪肝脏的保护作用。结果表明，褪黑素降低了IUGR发生率，改善了胎儿体重和肝脏指数，并减轻了肝脏结构紊乱、胶原沉积及肝星状细胞活化。同时，褪黑素降低了丙二醛（MDA）水平，恢复了超氧化物歧化酶（SOD）活性和总抗氧化能力（T-AOC），有效缓解了氧化应激。转录组学验证显示，褪黑素部分逆转了IUGR诱导的细胞外基质基因（如COL1A2、COL3A1）上调和抗氧化基因（如GSTA1、GPX3）下调，从而使肝脏转录谱向正常胎儿方向偏移。体外实验进一步证实，褪黑素抑制了LX-2细胞活化及胶原过表达。综上所述，妊娠期补充褪黑素可通过缓解氧化应激和重塑转录组来减轻IUGR胎猪与纤维化相关的改变，为产前干预提供了新的依据。

论文解读

一、研究背景与科学问题

宫内发育迟缓（Intrauterine Growth Restriction, IUGR）指胎儿在宫内未能实现其遗传决定的生长潜能，是全球最常见的围产期并发症之一，发生率约为5%–10%。在养猪生产中，IUGR同样普遍存在并造成显著的经济损失。IUGR不仅导致低出生体重，更重要的是可引发多器官发育异常。肝脏作为胎儿代谢和造血的核心器官，尤其容易受到宫内营养缺乏的影响。流行病学研究和动物实验已证实，IUGR胎儿表现为肝脏体积减小、肝细胞增殖能力下降，且远期发生非酒精性脂肪性肝病、肝纤维化甚至肝硬化的风险显著升高。因此，探索宫内阶段的有效干预策略以保护IUGR胎儿肝脏发育具有重要的临床意义。

肝纤维化是以细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）过度沉积为特征的病理过程，其核心事件是肝星状细胞（Hepatic Stellate Cell, HSC）在损伤刺激下活化转化为肌成纤维细胞，进而大量合成I型和III型胶原等ECM成分。氧化应激是驱动HSC活化和肝纤维化发生的关键上游因素。在IUGR条件下，胎盘功能不全导致胎儿缺血缺氧，再灌注损伤诱导大量活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）产生，从而显著升高肝脏氧化应激水平。

褪黑素（N-乙酰-5-甲氧基色胺）是由松果体合成的一种内源性激素，也是一种强效广谱抗氧化剂。与传统抗氧化剂不同，褪黑素及其代谢产物可直接清除多种自由基，并可通过激活Nrf2-ARE抗氧化通路诱导内源性抗氧化酶表达，发挥直接和间接的双重抗氧化作用。近年来，褪黑素在肝纤维化防治领域受到广泛关注。然而，褪黑素能否在宫内阶段干预IUGR胎猪肝脏的早期纤维化改变并改善肝脏功能，此前尚未见报道。

基于上述背景，研究人员提出假设：妊娠中期母体补充褪黑素可通过恢复抗氧化能力和逆转异常肝脏转录谱，减轻IUGR诱导的肝脏氧化应激和纤维化倾向。研究以中期妊娠胎猪为模型，系统比较正常组、IUGR组和褪黑素干预组之间的体重和体况、肝脏形态学变化、抗氧化能力及转录组谱，并初步探索其潜在分子机制。

二、研究设计与主要技术方法

本研究使用北京丰森源农业发展有限公司提供的初产法国系长白×大白母猪（约1岁，体况相近，平均体重约200 kg）作为动物模型。6头妊娠第60天的母猪随机分为两组（每组n=3）：对照组（基础日粮）和褪黑素处理组（基础日粮每日添加2 mg/kg褪黑素），从妊娠第60天至第90天连续补充。妊娠第90天屠宰母猪，采集胎猪肝脏组织。根据既定标准，胎猪体重低于同窝平均体重两个标准差的定义为IUGR。对照组胎猪分为CN（正常体重对照）和CI（IUGR对照）亚组，褪黑素组胎猪分为MN（正常体重褪黑素）和MI（IUGR褪黑素）亚组。每头母猪随机选取一头正常体重胎猪和一头IUGR胎猪进行组织采样，以母猪/窝为实验单元，每组n=3。

主要技术方法包括：苏木精-伊红（HE）染色评估肝脏组织学形态；天狼星红染色定量胶原沉积面积；α-SMA免疫组织化学染色评估肝星状细胞活化；生化试剂盒检测丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和总抗氧化能力（T-AOC）；肝脏组织RNA-seq转录组测序（每组3个生物学重复，平均测序深度6.48 Gb，比对参考基因组Sus scrofa）；LX-2人肝星状细胞系体外实验，采用CCK-8法筛选H₂O₂和褪黑素浓度，流式细胞术检测ROS水平，RT-qPCR验证纤维化和抗氧化相关基因表达。

三、研究结果

3.1 褪黑素补充对IUGR发生率、胎猪体重和肝脏指数的影响

与对照组相比，褪黑素补充组IUGR胎儿比例显著降低（p<0.05），表明妊娠期补充褪黑素有助于降低IUGR发生风险。褪黑素组胎猪平均体重呈非显著升高趋势；MI组IUGR仔猪体重和肝脏指数较CI组均呈非显著升高趋势。

3.2 褪黑素对IUGR胎猪肝脏组织病理学和纤维化标志物的影响

HE染色显示，CI组肝脏出现明显的结构紊乱、肝索排列松散、散在肝细胞水肿和局灶性炎性细胞浸润；MI组肝脏形态明显改善，肝索趋于规则排列，细胞水肿和炎症浸润显著减少。天狼星红染色显示，CI组胶原纤维沉积显著增加，主要分布于血管周围和小叶间区域；MI组胶原沉积较CI组显著减少。α-SMA免疫组化显示，CI组α-SMA阳性细胞数量显著增加，主要定位于窦周间隙和纤维间隔；MI组α-SMA阳性信号较CI组明显减弱。定量分析证实，褪黑素有效抑制了IUGR诱导的肝脏胶原过度积累和HSC活化。

3.3 褪黑素对IUGR胎猪肝脏抗氧化能力的影响

CI组肝脏MDA水平显著高于CN组（p<0.01），SOD活性显著低于CN组（p<0.05），T-AOC水平显著低于CN组（p<0.001），表明IUGR胎猪肝脏脂质过氧化加剧、抗氧化酶防御系统受损。MI组MDA水平显著低于CI组（p<0.05），SOD活性和T-AOC水平显著高于CI组（p<0.05），表明褪黑素有效缓解了IUGR诱导的肝脏氧化应激。

3.4 褪黑素对IUGR胎猪肝脏转录组谱的影响

主成分分析（PCA）显示，CN组和MI组样本紧密聚集，转录组谱高度相似；CI组与CN组明显分离。差异表达基因（DEG）分析显示，以CN为参照，CI组有533个基因上调和347个基因下调；以CI为参照，MI组有303个基因上调和342个基因下调，其中许多基因的表达方向与IUGR相关DEG相反。层次聚类热图进一步证实，CN组和MI组基因表达模式相似并聚为一类，CI组形成独立聚类，表明褪黑素处理促进了肝脏转录组的部分正常化。

3.5 褪黑素对IUGR胎猪肝脏差异表达基因功能富集的影响

基因本体（GO）富集分析显示，CI vs. CN比较中上调基因显著富集于细胞外基质、细胞外空间、细胞粘附、细胞外基质组织等条目；CI vs. CN比较中下调基因显著富集于小分子代谢过程、脂质代谢过程、类固醇代谢过程、抗氧化活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性等条目。MI vs. CI比较中，MI组下调基因的富集条目与CI vs. CN上调基因高度一致，MI组上调基因的富集条目与CI vs. CN下调基因高度一致，表明褪黑素处理部分逆转了IUGR引起的转录改变。

京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析显示，CI vs. CN上调基因显著富集于ECM-受体相互作用、局灶粘附、PI3K-Akt信号通路；下调基因主要富集于过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号通路、胆固醇代谢、谷胱甘肽代谢等代谢和抗氧化相关通路。MI vs. CI的富集模式与上述比较呈对应逆转关系。此外，CI组中COL1A2、COL3A1、COL6A2、ACTA2表达呈上调趋势，GSTA1、GSTA4、GPX3、MGST2呈下调趋势；MI组中上述胶原基因表达呈下调趋势，抗氧化基因呈上调趋势。

3.6 褪黑素对IUGR胎猪肝脏纤维化相关基因mRNA表达的影响

RT-qPCR验证显示，CI组ACTA2、COL1A2 mRNA表达显著高于CN组（p<0.05），COL3A1呈明显上调趋势（p=0.06），COL6A2显著高于CN组；MI组ACTA2、COL1A2、COL3A1表达较CI组显著降低，COL6A2呈下降趋势（p=0.05）。抗氧化基因方面，CI组GSTA1、GPX3、MGST2 mRNA表达均显著低于CN组（p<0.05），而MI组三者表达均显著高于CI组（p<0.05），恢复至与MN组相当的水平。

3.7 褪黑素对H₂O₂诱导的LX-2细胞活化和胶原基因表达的影响

CCK-8筛选确定200 μmol/L H₂O₂为造模浓度（细胞活力降至对照约80%），100 μmol/L褪黑素为工作浓度。与单独H₂O₂处理组相比，褪黑素预处理显著提高细胞活力（p<0.01），显著降低细胞内ROS水平（p<0.05）。H₂O₂组GSTA1、GPX3、MGST2表达显著下调，褪黑素预处理显著恢复这些抗氧化基因的表达。H₂O₂组ACTA2、COL1A1、COL3A1表达显著上调，褪黑素预处理显著抑制了这些纤维化相关基因的上调。

四、讨论与结论

讨论部分指出，本研究首次系统研究了妊娠中期母体补充褪黑素对IUGR胎猪肝脏发育的影响。研究证实产前褪黑素补充不仅显著降低了IUGR发生率，还有效改善了IUGR诱导的胎猪肝脏结构损伤、胶原沉积和肝星状细胞活化。保护机制可能与其强效抗氧化能力密切相关：褪黑素显著降低了IUGR胎猪肝脏脂质过氧化水平（MDA），同时恢复了受损的SOD活性和T-AOC。转录组测序和验证实验进一步揭示，褪黑素在转录水平上部分逆转了IUGR诱导的ECM基因上调和抗氧化基因下调，使转录谱向正常胎儿方向偏移而非完全正常化。体外实验证实褪黑素有效抑制了H₂O₂诱导的LX-2细胞活化和胶原基因过表达。

研究人员强调，IUGR胎猪肝脏中观察到的改变反映的是早期促纤维化表型/类纤维化改变，而非完全确立的成人型肝纤维化。LX-2细胞结果仅提供支持性机制提示，不能作为胎猪肝脏体内机制的直接证据。研究未直接测量胎肝褪黑素浓度、母体血浆褪黑素浓度或褪黑素受体丰度，胎盘转运和实际胎肝暴露为推断而非直接证明。Nrf2通路激活未在蛋白水平直接测量，PI3K-Akt和PPAR通路的功能验证未进行，均为假设性候选通路。

研究结论：本研究通过体内和体外实验系统证明，妊娠期补充褪黑素可显著降低IUGR发生率，改善胎猪体重和肝脏指数，并可能通过减轻氧化应激和重塑肝脏转录组谱有效缓解IUGR胎猪肝脏纤维化相关改变。这些发现不仅加深了对IUGR相关肝损伤机制的理解，也为开发安全有效的产前干预策略开辟了新途径。