β-葡聚糖、牛磺酸与L-精氨酸在CoCl2处理H9c2心肌母细胞中的体外机制及运动员补充富β-葡聚糖蘑菇提取物的前后对照研究

《Antioxidants》：In Vitro Mechanisms of β-Glucan, Taurine, and L-Arginine in CoCl2-Treated H9c2 Cardiomyoblasts and a Pre–Post β-Glucan-Rich Mushroom Extract Study in Athletes

　　

摘要 营养保健品β-葡聚糖、牛磺酸和L-精氨酸在低氧条件下的作用及其对运动员的意义尚不明确。研究人员在体外评估了这些化合物，并在运动员中测试了β-葡聚糖补充效果。研究人员将H9c2心肌母细胞暴露于CoCl2诱导的化学低氧环境中，以评估代谢活性、形态学、转录谱及线粒体/糖酵解功能。在一项非对照、单臂前后试验中，50名男性运动员接受了富β-葡聚糖蘑菇提取物（320 mg/天）补充，为期40天。在补充前后评估了身体成分、全血细胞计数及心肺运动试验。CoCl2将MTT代谢活性降低至对照组的67.29 ± 0.87%。三种化合物均显著提高了MTT代谢活性（83.65–97.40%；与阳性对照相比p < 0.001）。牛磺酸、β-葡聚糖和L-精氨酸均降低了Hif1a转录本（FC = 0.44、0.58和0.47；均与阳性对照相比p < 0.001）。Seahorse检测显示线粒体参数得到部分保留，糖酵解储备得到改善，其中L-精氨酸（120.4%）和牛磺酸（105.1%）数值上高于阴性对照（86.0 ± 20.2%），但两者差异均无统计学意义。转录改变具有化合物特异性且属于探索性发现。补充多蘑菇提取物40天的运动员相对VO2/kg升高（46.26 ± 2.33至53.12 ± 3.75 mL/min/kg；+14.8%；p < 0.001），绝对VO2升高（3138.46 ± 313.38至3503.82 ± 371.73 mL/min；+11.6%；p < 0.001），峰值RQ升高（1.096 ± 0.048至1.308 ± 0.082；p < 0.001）。HCT下降（44.53 ± 2.81%至42.10 ± 2.64%；p < 0.001），MCV升高（86.37 ± 2.20至89.67 ± 2.32 fL；p < 0.001），MCHC下降（35.10 ± 0.80至33.78 ± 0.53 g/dL；p < 0.001）。WBC水平降低（7.53 ± 1.31至6.80 ± 1.02 × 103/μL；p = 0.004），中性粒细胞下降（61.00 ± 8.34%至52.02 ± 5.66%；p < 0.001），淋巴细胞升高（27.80 ± 3.67%至35.17 ± 1.65%；p < 0.001），单核细胞升高（2.75 ± 0.44%至4.35 ± 0.64%；p < 0.001）。人体研究部分为非对照、单臂、前后设计，无安慰剂、随机化或盲法；因此，结果为假设生成性的。在CoCl2处理的H9c2细胞中，这些化合物改善了代谢活性并部分保留了生物能量学功能。非对照的人体试验提示β-葡聚糖补充可改善有氧表现并改变血液学指标，但需随机对照试验以证实这些初步发现。

研究背景与目的

心血管疾病是全球首要死因，心肌缺氧是缺血性损伤的重要组成部分。缺氧破坏线粒体电子传递链，复合物I/III泄漏电子形成超氧化物，进而生成H₂O₂和羟自由基，氧化mtDNA、损伤心磷脂并开放线粒体通透性转换孔，限制ATP产生并触发细胞死亡通路。同时，线粒体功能障碍促进促炎信号并进一步损害细胞生物能量学，最终导致心肌细胞死亡、收缩功能障碍和永久性心脏损伤。除缺血外，高强度运动也会导致运动员相对缺氧，高强度耐力运动可使骨骼肌和心肌供氧不足，引起局部缺氧、活性氧升高和暂时性免疫抑制。剧烈运动还会升高应激激素和炎症细胞因子，阻碍恢复并增加赛后数日感染风险。运动员可能受益于针对缺氧耐受、氧化还原平衡和免疫力的营养干预，但很少有营养保健品先在缺氧相关心脏模型中进行测试，这一空白促使了本研究开展。β-葡聚糖、牛磺酸和L-精氨酸可通过独立但可能互补的策略减轻缺氧细胞应激，但它们在缺氧暴露的心肌母细胞中的比较效应——线粒体生物能量学和转录水平信号——此前未被研究。研究人员使用统一的缺氧技术、共享的代谢、转录组和形态学检测方法，在H9c2心肌母细胞中比较了三种化合物，并在男性运动员中评估了40天β-葡聚糖补充对心肺功能、血液学和身体成分的影响。

主要技术方法

体外实验使用H9c2大鼠胚胎心肌母细胞系，以200 μM CoCl₂诱导化学缺氧并稳定HIF-1α，处理24小时。治疗组包括阴性对照（未处理）、阳性对照（仅CoCl₂）、β-葡聚糖组（20 μg/mL）、牛磺酸组（40 μM）和L-精氨酸组（50 μM）。采用MTT比色法评估代谢活性，相差显微镜评估形态学，RT-qPCR检测8个靶基因（Hif1a、Sh2b1、Apoa5、Csk、Pcsk9、Myl2、Apoe、Lpl）的mRNA表达，Seahorse XFe24细胞外通量分析仪进行线粒体应激测试、糖酵解应激测试和实时ATP速率测定。人体研究为一项非对照、单臂、前后试点试验，纳入50名健康男性运动员（年龄20.5 ± 1.3岁），经14–17天洗脱期后接受40天富β-葡聚糖蘑菇提取物补充（320 mg/天，含约100 mg β-葡聚糖），使用心肺运动试验（CPET，Bruce方案）、全血细胞计数和生物电阻抗分析（BIA）评估干预效果。

研究结果

体外评估：MTT检测。 阳性对照组代谢活性显著降至67.28 ± 0.93%，三种化合物均显著提高代谢活性（β-葡聚糖83.57%，牛磺酸97.27%，L-精氨酸94.62%，均p < 0.001）。细胞无MTT直接还原，排除了假阳性。

形态学评估。 CoCl₂导致细胞收缩、变圆、脱落和单层破坏。牛磺酸和L-精氨酸提供较强保护，维持纺锤形形态和单层完整性；β-葡聚糖改善形态但仍有部分变圆和融合度丧失。

RT-qPCR基因表达分析。 CoCl₂使Hif1a（+77%）和Pcsk9（+99%）表达升高，Myl2和Lpl表达降低。三种化合物均显著降低Hif1a转录本（β-葡聚糖FC = 0.58，牛磺酸FC = 0.44，L-精氨酸FC = 0.47）。β-葡聚糖降低Pcsk9（FC = 0.750）、Apoe（FC = 0.496）、Myl2（FC = 0.051）、Lpl（FC = 0.240）、Apoa5（FC = 0.533）和Csk（FC = 0.441）。牛磺酸降低Myl2（FC = 0.111）、Pcsk9（FC = 0.850）、Lpl（FC = 0.229）和Csk（FC = 0.412）。L-精氨酸的SH2B1转录本高于阳性对照（FC = 0.848 vs 0.703），Myl2（FC = 0.009）、Lpl（FC = 0.124）、Apoa5（FC = 0.439）和Csk（FC = 0.334）降低。这些转录改变为探索性发现。

Seahorse代谢分析。 线粒体应激测试显示，三种处理组的基线呼吸、最大呼吸和备用呼吸能力均显著高于阳性对照（p < 0.001）。ATP相关呼吸方面，牛磺酸显著高于阳性对照（p ≈ 0.020），β-葡聚糖临界（p ≈ 0.053），L-精氨酸无显著差异。牛磺酸在多数线粒体参数中数值最高，L-精氨酸耦合效率（31.5%）和备用呼吸能力百分比（74.2%）最高。处理组ATP相关呼吸约为阴性对照的75–82%，表明部分而非完全恢复。糖酵解应激测试显示，处理组糖酵解储备为10.2–11.2 mpH/min，而阳性对照几乎无储备（0.7 ± 0.5 mpH/min）。ATP速率测定显示，处理组线粒体ATP产量（35.0–44.0 pmol/min）显著高于阳性对照（14.6 ± 4.0 pmol/min），牛磺酸产量最高（44.0 ± 2.5 pmol/min），约为阳性对照的三倍。阴性对照XF ATP速率指数最高（1.19 ± 0.01），牛磺酸次之（1.16 ± 0.03），表明氧化代谢表型。

人体干预研究。 50名运动员完成试验，依从性100%。补充40天后，相对VO₂/kg从46.26 ± 2.33升至53.12 ± 3.75 mL/min/kg（+14.8%，p < 0.001，Cohen's d_z = 1.60），绝对VO₂从3138.46 ± 313.38升至3503.82 ± 371.73 mL/min（+11.6%，p < 0.001），峰值RQ从1.096升至1.308（p < 0.001），VE从111.16升至120.38 L/min（p = 0.033），VE/VCO₂从29.00升至31.64（p < 0.001），峰值心率从195.6降至188.0 bpm（p = 0.034），力竭时间从612.2 ± 39.6秒增至667.1 ± 44.6秒（+54.9秒，p < 0.001）。但基线时仅22/50名参与者满足至少两项最大努力标准，基线平均峰值RQ（1.096）低于1.10阈值，提示部分VO₂增加可能反映更大努力而非真实生理适应。血液学方面，HCT从44.53%降至42.10%（p < 0.001），MCV从86.37升至89.67 fL（p < 0.001），MCHC从35.10降至33.78 g/dL（p < 0.001），血红蛋白和RBC计数保持稳定。WBC从7.53降至6.80 × 10³/μL（p = 0.004），中性粒细胞百分比从61.00%降至52.02%（p < 0.001），淋巴细胞从27.80%升至35.17%（p < 0.001），单核细胞从2.75%升至4.35%（p < 0.001）。身体成分参数（体重、骨骼肌质量、体脂质量、BMI、肌肉质量）均无显著变化，所有差异均在BIA测量误差范围内。

讨论与结论

讨论部分指出，三种营养保健品在CoCl₂处理的H9c2心肌母细胞中部分保留了线粒体参数，增加了糖酵解储备，并将ATP相关呼吸恢复至阴性对照的75–82%，其中牛磺酸显示出最有利的线粒体和ATP参数。转录水平分析显示L-精氨酸是最一致平衡和具有保护性的干预，其转录谱与其作为一氧化氮（NO）前体的机制一致。三种化合物均显示可能与PI3K/AKT通路相关的转录改变，但未在蛋白水平验证。人体研究部分强调，40天β-葡聚糖补充与有氧表现改善和血液学改变相关，但该试验为非对照、非盲法设计，无法区分补充效应与训练适应、跑步机熟悉效应和均值回归。β-葡聚糖富集蘑菇提取物含≥32% β-葡聚糖，其余约68%可能含其他生物活性成分（如三萜类、虫草素、多酚），因此人体观察到的效应不能单独归因于β-葡聚糖。结论指出，在CoCl₂处理的H9c2心肌母细胞中，β-葡聚糖、牛磺酸和L-精氨酸改善了MTT代谢活性，降低了Hif1a mRNA，并部分保留了线粒体和糖酵解参数；转录改变具有化合物特异性且为探索性发现。40天β-葡聚糖补充与VO₂峰值升高相关，但基线CPET最大努力标准满足率低，部分增加可能反映更大努力而非生理适应。由于未使用安慰剂、随机化、盲法、心脏功能或损伤标志物，这些人体数据为假设生成性，不能证明因果关系或心脏保护作用。需要随机安慰剂对照试验、更长随访、适当控制饮食和训练变量以及直接心血管终点，才能推荐β-葡聚糖作为运动员营养策略。