基于UHPLC–Q-TOF–MS非靶向代谢组学与抗氧化谱的鱼腥草根茎与叶组织特异性化学分化研究

《Antioxidants》：Integrated Untargeted Metabolomics and Antioxidant Profiling Reveal Tissue-Specific Chemical Differentiation Between Rhizomes and Leaves of Houttuynia cordata

　　

鱼腥草（Houttuynia cordata）兼作食品和药用，然而其根茎（RZ）与叶（LF）的非挥发性化学谱及体外抗氧化能力的整合比较仍有限。研究人员采用基于超高效液相色谱–四极杆飞行时间质谱（UHPLC–Q-TOF–MS）的非靶向代谢组学、全峰表功能分析、京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析、总酚和总黄酮含量测定以及四种抗氧化试验，对来自10个批次的10份根茎（RZ）和10份叶（LF）样品进行了比较。两种离子模式下均出现明显分离。在原始基于Welch检验的探索性筛选中，变量投影重要性（VIP）> 1、绝对log₂倍数变化 > 1且Benjamini–Hochberg校正q < 0.05，分别在正离子和负离子模式下获得436个和232个具有推定注释的差异特征，其中以LF富集特征为主。65个黄酮相关特征中有64个在LF中富集。功能分析和KEGG分析提示，差异可能涉及氨基酸代谢、黄酮和黄酮醇生物合成以及脂质相关过程。LF的总酚和总黄酮含量以及自由基清除和铁还原能力均高于RZ（均q < 0.001）。基于LF富集、化学类别和注释质量进行优先级筛选，得到20个酚类和黄酮类特征，归属于9个候选注释组。这些发现支持对RZ和LF进行差异化质量评价和利用。

鱼腥草（Houttuynia cordata）为药食两用植物，其根茎（RZ）与叶（LF）在食用和药用利用上存在差异，但二者非挥发性化学谱与体外抗氧化能力的整合比较仍有限。已有研究报道了挥发物的组织分布及部分非挥发性成分差异，但将较广泛的非挥发性化学谱与多指标抗氧化试验结合，并据此优先筛选候选酚类和黄酮类特征的研究仍不足。为此，研究人员比较了RZ与LF的非挥发性代谢谱和体外抗氧化能力，并对LF富集的酚类和黄酮类特征进行优先级筛选，以支持组织特异性质量评价和差异化利用。

研究人员所用10批全草于同一天购自中国四川省雅安市雨城区6个农贸市场的10个摊贩，经Bixing Gao依据形态特征鉴定为Houttuynia cordata；每批全草分别分离根茎和叶，40 °C干燥后粉碎，形成10个复合RZ样品和10个复合LF样品，并按同一批次编号进行配对分析。研究采用UHPLC–Q-TOF–MS非靶向代谢组学，在正离子（POS）和负离子（NEG）模式下采集数据，结合METLIN数据库和MS-DIAL进行特征提取与推定注释；采用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）评价组间分离，以VIP > 1、|log₂FC| > 1和Benjamini–Hochberg错误发现率（BH–FDR）校正q < 0.05筛选差异特征，并进行批匹配配对敏感性分析；利用MetaboAnalyst进行基于全峰表的功能分析（mummichog与基因集富集分析，GSEA）和基于推定注释特征的KEGG通路分析；测定总酚含量（TPC）和总黄酮含量（TFC），并开展DPPH、ABTS、铁还原抗氧化能力（FRAP）和羟自由基（·OH）清除四种体外抗氧化试验；最后结合LF富集方向、化学类别和注释质量对候选特征进行优先级筛选。上述方法概括不超过250字，未涉及试剂和具体前处理操作细节。

研究结果如下。3.1 Selection of Analytical Conditions and Stability Assessment（分析条件选择与稳定性评价）：通过比较提取溶剂和流动相，选择80%甲醇提取、0.1%甲酸水–乙腈流动相；5次质量控制（QC）进样中，POS和NEG模式下25个代表性特征离子的保留时间平均相对标准偏差（RSD）分别为0.18%和0.22%，m/z平均RSD均< 0.001%，峰面积平均RSD分别为6.11%和5.58%，支持分析序列内仪器稳定性和进样重复性。3.2 Overview of Untargeted Metabolomics Data Acquisition and Feature Annotation（非靶向代谢组学数据采集与特征注释概览）：POS模式获得9636个对齐特征，其中2080个获初步候选注释；NEG模式获得7094个对齐特征，其中1247个获初步候选注释；完整预处理特征矩阵用于多变量统计和功能分析，严格筛选的推定注释差异特征用于KEGG通路分析。3.3 Integrated PCA and OPLS-DA Reveal Differences Between the Metabolic Profiles of RZ and LF（整合PCA和OPLS-DA揭示RZ与LF代谢谱差异）：PCA显示两组在POS和NEG模式下均明显分离，POS的PC1和PC2分别解释43.6%和11.3%方差，累计54.9%，NEG分别解释40.8%和12.8%，累计53.6%；OPLS-DA模型POS的R²X=0.693、R²Y=0.997、Q²=0.962，NEG的R²X=0.567、R²Y=0.998、Q²=0.962；200次置换检验和交叉验证方差分析（CV-ANOVA）显示POS模型F=42.93、p=1.47×10^?7，NEG模型F=54.16、p=1.89×10^?8；作者同时指出高R²截距需谨慎，负Q²截距和显著CV-ANOVA提供内部验证证据，但不能排除过拟合或建立外部预测性能。3.4 Differential Metabolic Features Between RZ and LF（RZ与LF差异代谢特征）：按VIP > 1、|log₂FC| > 1和BH–FDR校正q < 0.05，POS和NEG分别获得436个和232个具推定注释的显著差异特征；POS中293个在LF较高、143个在RZ较高，NEG中167个在LF较高、65个在RZ较高；批匹配配对敏感性分析中，POS的424/436（97.25%）和NEG的229/232（98.71%）保留BH校正q < 0.05；化学类别上，POS以萜类16.28%、脂肪酸15.83%、黄酮8.26%、甘油酯8.26%和酚类9.40%为主，NEG以萜类16.81%、脂肪酸14.66%、黄酮12.50%、酚类10.34%和磷脂6.90%为主；65个黄酮差异特征中64个在LF富集，萜类则呈双向分布；热图显示黄酮、酚类、脂肪酸和甘油酯相关特征多位于LF较高区域。3.5 Functional Analysis and KEGG Pathway Analysis Further Characterize Potential Metabolic Pathway Differences Between RZ and LF（功能分析和KEGG通路分析进一步表征潜在代谢通路差异）：基于全峰表的功能分析在POS和NEG分别有4条和23条通路满足p < 0.05，POS主要涉及植物次生代谢物生物合成、花生四烯酸代谢、黄酮和黄酮醇生物合成及萜类骨架生物合成，NEG主要涉及氨基酸生物合成与代谢、脂肪酸代谢、抗坏血酸和醛酸代谢及三羧酸循环；基于差异推定注释特征的KEGG分析有8条通路满足p < 0.05，主要涉及氨基酸生物合成与代谢、黄酮和黄酮醇生物合成、脂肪酸生物合成及醚脂代谢；两类分析提示差异可能涉及氨基酸代谢、黄酮和黄酮醇生物合成及脂质相关过程，但相关通路仍需实验验证。3.6 Total Phenolic and Flavonoid Contents, In Vitro Antioxidant Activity, and Their Correlations in RZ and LF（RZ与LF总酚、总黄酮、体外抗氧化活性及其相关性）：LF的TPC、TFC及四种体外抗氧化指标均显著高于RZ，六项配对比较的BH校正q均< 0.001；DPPH、ABTS和FRAP的LF–RZ差异约为14–15倍，·OH清除能力差异约为5倍；合并LF和RZ样本时，TPC和TFC与四种抗氧化指标呈正Spearman相关，六项指标间相关系数ρ为0.588–0.881；但在LF和RZ组织内分别分析时，经BH校正后均未保留显著相关，提示合并相关可能部分反映组织间差异，不能据此建立独立或因果贡献。3.7 Prioritization of Differential Features Potentially Associated with Antioxidant Activity in LF（LF中潜在与抗氧化活性相关差异特征的优先级筛选）：从显著差异推定注释特征中筛选LF富集的黄酮和酚类特征，得到64个黄酮特征和49个酚类特征，构成113个初始候选池；进一步保留单一候选名称且库匹配分数≥80者，获得20个高优先级特征，包括16个黄酮和4个酚类特征，其中POS 13个、NEG 7个，所有特征均在LF较高，log₂FC为1.39–7.41，且均保留批匹配配对BH校正q < 0.05；按去除数字后缀的基础候选名归组，20个特征归入rutin、hyperoside、quercetin、luteolin 4′-O-glucoside、kaempferol 7-O-glucoside、fisetin、biorobin、genkwanin和chlorogenic acid共9个候选注释组，其中rutin、quercetin和chlorogenic acid相关组各含4个特征，hyperoside相关组含3个；同一候选组内多特征可能代表不同离子信号、异构体、冗余峰检测或数据库不能区分的近缘结构，不能将特征数直接等同于独立化合物数；20个高优先级特征与四种抗氧化指标在合并数据集中呈正相关（Spearman ρ=0.532–0.835），但组织内关联经多重校正后证据有限。

讨论部分指出，LF较高TPC和TFC可能与其长期受光照和环境胁迫的生理背景有关；不同体外抗氧化试验机制并不相同，DPPH和ABTS主要评价自由基清除反应，FRAP主要反映供电子和还原能力，·OH试验还受羟自由基生成、竞争反应和捕获动力学影响，因此单一试验不能完整表征样品全部抗氧化性质，体外结果不能直接外推至体内抗氧化功效。合并样本的相关性支持组织水平上的共变，但不证明TPC或TFC对抗氧化能力具有独立或因果贡献；优先级筛选整合了组织富集方向、化学类别和注释质量，候选化合物的身份及其对抗氧化活性的贡献仍需标准品、靶向定量和活性导向评价确认。

研究结论翻译：鱼腥草根茎和叶表现出不同的非挥发性化学谱和体外抗氧化能力。叶具有较高的总酚和总黄酮含量，并在四种试验中表现出更强的抗氧化反应，同时伴随黄酮相关特征的一致富集。这些发现支持对两种植物部位进行组织特异性质量评价和差异化利用。所优先筛选的酚类和黄酮类特征为进一步研究提供了候选，但其身份及对抗氧化活性的贡献仍需通过标准品、靶向定量和活性测试加以确认。