基于分子印迹聚合物的蛋白质光学生物传感器研究进展

《Biosensors》：Overview of Molecularly Imprinted Polymer-Based Optical Biosensors for Protein Detection

蛋白质生物标志物在疾病的早期诊断、预后评估、治疗监测和疗效评价中发挥着不可或缺的作用。光学生物传感器因其免标记、实时和高灵敏度的特性，已成为蛋白质检测中极具前景的替代方案。分子印迹聚合物（MIPs）被誉为“塑料抗体”，可通过在聚合物基质中形成与目标互补的空腔，提供化学性质稳定、低成本且可定制的识别元件，因而在光学传感平台的集成应用中备受关注。本文系统总结了用于蛋白质检测的MIP基光学生物传感器的研究进展。首先介绍了生物传感器及识别元件的基本原理，并简要概述了印迹技术的关键组成部分，如印迹材料、功能单体、交联剂、聚合机制、模板固定策略和模板去除条件。随后，本文全面评估了MIPs与多种光学转导技术的集成应用，包括荧光、化学发光（CL）、电化学发光（ECL）、表面增强拉曼散射（SERS）、比色法和表面等离子体共振（SPR）。最后，讨论了该领域面临的主要挑战，并提出了未来的发展方向。本综述旨在为MIP基光学生物传感器在蛋白质检测中的合理设计、性能提升及临床转化提供系统的理论参考和有益见解。

1. 引言

蛋白质作为生理和病理状态的指示物，在疾病早期诊断、预后评估、治疗监测和疗效评价中发挥重要作用。传统蛋白质检测技术如高效液相色谱（HPLC）、液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）和酶联免疫吸附测定（ELISA）虽各有优势，但存在仪器昂贵、操作复杂、耗时长等局限。电化学传感器虽响应快、成本低，但蛋白质结构复杂、氧化还原活性中心常被埋藏，且复杂生物样本中干扰蛋白易在电极表面非特异性吸附，严重影响检测的稳定性、重现性和选择性。

光学生物传感器凭借独特的光物理转导机制成为极具潜力的替代方案。光学传感依赖光与物质的相互作用来转导分子识别事件，信号不易受生物样本中电活性物质干扰。特别是贵金属纳米材料及新兴二维材料的表面增强拉曼散射（SERS）和局域表面等离子体共振（LSPR）效应可产生高度增强的局域电磁场，实现超灵敏检测。此外，光纤和集成波导技术的快速发展推动了光学生物传感器的小型化和便携化，使其适用于即时检测（POCT）设备。

生物传感器由识别元件和信号转导元件两个关键部分组成。目前最广泛使用的识别元件包括抗体、核酸、多肽和分子印迹聚合物（MIPs）。抗体具有高亲和力和优异特异性，但制备耗时费力、成本高，对环境条件敏感，批次间差异可能影响重现性。核酸类识别元件成本低、可规模化合成，但易受核酸酶降解且存在非特异性静电吸附。多肽类识别元件兼具合成多样性和分子识别能力，但对靶标的结合亲和力通常较低。

为克服传统生物识别元件在稳定性、成本和制备时间方面的局限，MIPs作为全合成识别元件应运而生。其合成通常包括三个关键步骤：预聚合（模板与功能单体形成模板-单体复合物）、聚合（形成高交联三维聚合物网络）和模板去除（洗脱模板分子后留下与目标在尺寸、形状和官能团分布上互补的印迹空腔）。根据模板与功能单体间的相互作用类型，印迹方法可分为共价、非共价和半共价固定；根据聚合策略，可分为本体印迹、表面印迹、沉淀印迹和电聚合印迹。

将MIPs的高选择性识别能力与光学检测技术的高灵敏度相结合，已成为生物传感和成像领域的重要研究方向。与目前主导蛋白质检测的免疫分析相比，MIP基光学生物传感器具有显著优势：合成受体可耐受常温储存，单次检测材料成本降低数个数量级，均相或无洗涤检测模式可将检测时间缩短至数分钟。现有综述多聚焦于特定传感技术或广泛分析物，尚缺乏专门系统总结MIP基光学传感用于蛋白质生物标志物检测进展的综述。本文系统总结了分子印迹光学生物传感器在蛋白质检测中的发展，文献检索覆盖2006至2026年的出版物。

2. 印迹材料与方法

将各种纳米材料引入MIPs可扩展其功能和应用范围。磁性纳米颗粒赋予MIPs磁响应性，实现靶标在外加磁场下的快速分离和富集。量子点（QDs）和上转换纳米颗粒（UCNPs）因其优异的荧光特性被广泛用作构建印迹光学探针的核心材料。金属/金属氧化物纳米颗粒（特别是金和银）因其出色的光学和催化性能常被用于增强传感器性能。金属有机框架（MOFs）凭借极高的比表面积和规整的孔道结构可改善MIPs的吸附容量和传质效率。碳基材料（如碳纳米管（CNTs）和石墨烯）因其优异的导电性和机械强度被广泛用作载体或掺杂剂。

MIPs的识别性能从根本上取决于聚合体系中功能单体和交联剂的选择与配比。常用功能单体包括甲基丙烯酸（MAA）、丙烯酰胺（AAm）和4-乙烯基吡啶（4-VP），此外离子液体基功能单体和酚类小分子也受到越来越多关注。常用交联剂包括乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）、二乙烯基苯（DVB）和N,N′-亚甲基双丙烯酰胺（MBAAm）。聚合通常需要偶氮二异丁腈（AIBN）等引发剂在热或光化学条件下引发反应。

MIPs的物理形态和靶标识别可及性取决于其制备方法。传统本体印迹操作简单，但用于大分子时存在显著传质阻力和模板包埋问题。表面印迹将印迹位点限定在基底表面，便于模板去除并改善再结合动力学。表面引发原子转移自由基聚合（SI-ATRP）和可逆加成-断裂链转移聚合（RAFT）可精确控制印迹层厚度；紫外光引发的光聚合可在室温进行，特别适合热敏性生物大分子；电聚合可直接在电极表面氧化吡咯、苯二胺和苯酚等单体，形成超薄印迹膜。沉淀聚合和固相合成可制备尺寸相对均匀的微纳级MIP颗粒。

印迹条件和靶标固定方法共同决定识别位点的可及性和亲和能力。鉴于蛋白质表位的结构复杂性，表位印迹可将印迹靶标缩小至短的表面暴露肽序列，如N端或C端肽。根据模板固定方式，表位印迹可分为随机印迹、约束印迹和接枝印迹。总体而言，印迹策略已从本体印迹转向表面印迹、从完整蛋白质转向表位或蛋白结构域、从随机转向定向模板固定。

模板去除是决定MIPs识别位点质量和可及性的关键步骤。当前模板去除策略可分为五类：离液处理（使用尿素、十二烷基硫酸钠（SDS）、乙酸（HAc）或草酸）、盐处理（高浓度氯化钠（NaCl））、酸性裂解（HAc或盐酸（HCl））、碱性处理（氢氧化钠（NaOH）或碳酸盐溶液）以及蛋白水解处理（胰蛋白酶或蛋白酶K）。目前尚未建立普遍最优的模板去除方法，洗脱条件需针对具体MIP体系系统优化。

3. MIP基蛋白质检测生物传感器

3.1 荧光传感

分子印迹荧光传感器的性能取决于荧光材料的选择和信号转导机制的设计。荧光材料可分为两类：一类仅作为信号产生组分，需借助合适载体与MIPs集成，包括有机染料、半导体QDs、碳点（CDs）、金属纳米簇和UCNPs；另一类兼具信号产生和结构支撑双重功能，可直接作为印迹聚合的基底。

分子印迹荧光传感器主要依赖三种经典传感机制：荧光共振能量转移（FRET）、光诱导电子转移（PET）和内滤效应（IFE）。FRET发生在供体发射光谱与受体吸收光谱重叠且供体-受体距离在1–10 nm范围内时；PET基于荧光团与靶标或猝灭剂之间的电子转移；IFE源于靶标对激发光或发射光的吸收，不要求荧光团与靶标直接相互作用。此外还有等离激元增强和印迹层空间位阻调控机制。

早期研究使用染料标记材料作为荧光传感探针检测蛋白质，包括纳米颗粒、微球、凝胶、磁性颗粒、碳纳米管和试纸条或薄膜等。例如，Wang等制备了硼酸功能化的分子印迹纳米颗粒用于卵清蛋白（OVA）检测，检测限低至33.3 ag/mL。Tsutsumi等开发了以人血清白蛋白（HSA）为模板的分子印迹纳米凝胶，通过印迹后修饰引入荧光染料，检测限为13 nM。Sunayama等设计了含可裂解二硫键的功能单体，通过三步印迹后修饰在溶菌酶（Lyz）印迹空腔内位点特异性引入荧光报告分子。

聚集诱导发光（AIE）荧光团在溶解或分散态下荧光较弱，但聚集后发射显著增强，可引入印迹空腔中实现“开启”模式检测。荧光纳米材料与MIPs的集成也是重要研究方向，包括UCNPs、QDs纳米晶以及负载QDs和CDs的二氧化硅纳米颗粒、MOFs、碳纳米管、磁性材料等。Zhang等以CdTe纳米晶为核心制备了辣根过氧化物酶（HRP）响应纳米传感器。Li等通过溶胶-凝胶表面印迹在氨基功能化二氧化硅纳米颗粒表面构建了牛血红蛋白（BHb）印迹层。Liu等通过硫醇-烯点击化学将CDs共价锚定在SiO₂纳米颗粒表面，利用金属配位相互作用固定Lyz模板。

双发射和比率传感模式可进一步提高印迹荧光探针的信噪比。Wang等通过简单混合两种独立纳米材料实现了BHb的可视化比率荧光检测。Piloto等报道了基于MIP的基质金属蛋白酶7（MMP7）比率生物传感器。Zhou等设计了以Lyz和Fe³⁺为双模板的单激发双信号比率荧光传感器。

发光MOFs（LMOFs）由金属离子或簇与有机配体组装而成，其高比表面积和规整孔道结构可直接作为MIPs形成的支撑框架。Gao等合成了MOF-on-MOF异质结构（Eu-MOF@Ce-MOF），表面包覆针对SARS-CoV-2刺突蛋白（S蛋白）的分子印迹SiO₂层，构建了比率荧光传感器。Chen等报道了基于IFE机制的CD基近红外（NIR）荧光MIP纳米探针用于胰蛋白酶检测，检测限低至8.8 pg/L。

蛋白质还可基于其与荧光标记模板或靶标对有限数量MIPs的竞争结合来测定。Kuwata等通过转录分子印迹策略在玻璃基底上制备了MIP蛋白芯片阵列，实现四种蛋白质的同时检测。纳米级MIPs（nanoMIPs）可被小分子和荧光染料功能化，成为药物递送、生物传感和生物成像的有力工具。Xu等采用核壳nanoMIPs作为合成抗体开发了胰蛋白酶夹心荧光免疫分析。Mahajan等利用功能化磁性纳米颗粒制备nanoMIPs，建立了竞争性荧光置换分析方法。Liu等以表位肽功能化磁性纳米颗粒为模板，通过固相合成制备多功能nanoMIPs，实现了人血管紧张素转换酶2（ACE2）的无洗涤竞争性荧光置换检测，检测限低至81 fg/mL。Zhang等报道了脑钠肽（BNP）的检测，使用CD嵌入的分子印迹纳米颗粒，检测限低至0.208 pg/mL，160份临床血清样本检测结果与医院方法高度一致。

MIP基夹心模式也被广泛用于蛋白质生物标志物的荧光分析，采用双识别格式。MIP材料选择性捕获靶标蛋白后，连接荧光标记识别元件（如抗体、适配体或硼酸功能化纳米探针）形成夹心复合物，通过多重信号放大进一步提高灵敏度。Lu等利用碳纳米纤维负载Fe₃O₄纳米颗粒和MnO₂纳米片作为固相基底，结合MoS₂纳米花荧光标签，实现了癌胚抗原（CEA）的超灵敏检测，检测限为3.5 pg/mL。

3.2 化学发光和电化学发光方法

化学发光（CL）是由化学反应驱动的发光现象，无需外部激发光源，可有效避免光散射和激发强度波动引起的背景干扰。然而，在复杂生物或环境样本中，共存基质组分因CL反应缺乏分子识别能力而产生干扰信号。MIPs的引入为CL分析的选择性限制提供了有效解决方案。MIP基CL检测主要有两种策略：一是MIPs直接作为识别元件与CL检测耦合；二是MIPs替代传统抗体作为人工抗体，在仿生免疫分析中充当识别元件。

电化学发光（ECL）是在电极表面施加电位引发化学反应的发光过程，结合了CL无外部光源、低背景干扰的优势和电化学方法时空可控性、高灵敏度的优点。MIP基ECL生物传感器可分为信号增强和信号减弱两种模式。Li等开发了以氢氧根离子（OH^?）为新型共反应物的鲁米诺-OH^? ECL体系，用于尿酸（UA）、C反应蛋白（CRP）、免疫球蛋白G（IgG）和葡萄糖（Glu）的检测。Wang等利用氨基功能化银包覆铜纳米线（NH₂-Ag@CuNWs）作为准三维复合发光体，开发了甲胎蛋白（AFP）的超灵敏分子印迹ECL生物传感器，检测限为1.1 fg/mL。

He等构建了双靶标ECL免疫传感器，同时检测心肌肌钙蛋白I（cTnI）和肌红蛋白（Myo）两种急性心肌梗死生物标志物。Mo等利用ZnSe QD负载Fe(III)-MIL-88B-NH₂ MOFs作为信号探针，PDA-MIPs作为识别元件，实现了鳞状细胞癌抗原（SCCA）的超灵敏检测，检测限为31 fg/mL。Yang等报道了适配体-MIP双识别ECL生物传感器用于凝血酶检测。Jiang等制备了糖基印迹磁性Au@Fe₃O₄微球，结合适配体识别和裂解触发的Ru(bpy)₃²⁺探针释放，实现了癌症来源细胞外囊泡（EVs）的ECL检测。

MIPs可通过一步电聚合在电极表面原位制备，工艺简单且可精确控制膜厚。MIP基ECL生物传感器兼具电化学方法易于小型化的优势和光学检测的高灵敏度，在便携式即时检测设备开发方面显示出巨大潜力。

3.3 表面增强拉曼散射生物传感器

拉曼散射是入射光的非弹性散射，拉曼光谱被视为分子的“指纹”。SERS通过将靶标分子吸附到纳米结构贵金属表面，利用表面等离子体共振产生的电磁增强效应和电荷转移相关的化学增强效应，可提供接近甚至达到单分子检测水平的灵敏度。与传统荧光光谱相比，SERS具有优异的光稳定性、窄光谱带、丰富的分子结构信息和多重检测潜力。

MIPs作为人工抗体，可为SERS基底提供精确的分子识别能力。当MIPs集成到SERS基底表面作为捕获层时，不仅能选择性富集复杂样本中的靶标分析物并使其靠近金属表面的电磁“热点”，还能有效防止样本基质中大分子和干扰物的非特异性吸附，从而提高信噪比。MIP基SERS生物传感器通常分为免标记和标记两种检测策略。

拉曼报告分子可作为指示剂间接反映靶标识别事件。MIPs中的印迹空腔是拉曼报告分子穿透到达底层SERS基底的唯一通道。当靶标蛋白特异性识别并占据印迹空腔时，报告分子的扩散通道被物理阻断，导致SERS信号减弱。Arabi等在玻璃毛细管内壁组装金纳米星（AuNSs）作为基底，表面包覆贻贝启发的表面印迹聚多巴胺（PDA）层，实现了胰蛋白酶等多种蛋白质的超灵敏免标记检测。Wang等以蛋白水解肽为模板印迹Fe₃O₄/ZrO₂/Ag/4-MBA@SiO₂颗粒，实现了cTnI的磁性SERS检测，检测限为0.063 pg/mL。Shang等报道了利用ZrO₂包覆银纳米线（AgNWs@ZrO₂）MIPs对EpCAM的SERS检测。Chen等开发了单微液滴印迹策略，在等离激元基底上制备PDA分子印迹纳米空腔，实现了细胞外囊泡表面蛋白的免标记检测。

夹心策略采用两种识别元件（如MIPs加适配体、MIPs加抗体或具有不同表位印迹位点的MIPs），通过形成“捕获探针-靶标-信号探针”夹心结构识别靶标蛋白的不同位点。信号探针通常由修饰拉曼活性报告分子的贵金属纳米颗粒组成，通过SERS效应产生增强的拉曼信号。夹心模式通过双识别提供增强的特异性和亲和力，而Au-Ag体系的等离激元耦合效应可进一步放大SERS信号，实现蛋白质的高灵敏检测。Ye等首次提出了硼亲和夹心分析，以大孔硼酸基分子印迹整体柱为捕获单元，MPBA功能化AgNPs作为SERS探针，实现了糖蛋白的无抗体、无酶检测。