从细胞相关硼递送到体内耐受性：负载BPA的TAT-脂肽修饰脂质体用于BNCT的多功能递送与急性耐受性评估

《Pharmaceutics》：Evaluation of BPA-Bearing TAT-Lipopeptide-Modified Liposomes for Boron Neutron Capture Therapy from Cell-Associated Boron Delivery to In Vivo Tolerability

　　

背景/目的：硼中子俘获治疗（boron neutron capture therapy, BNCT）需要将足量¹⁰B高效递送至肿瘤细胞。本研究评估了基于B5-TAT-脂肽的脂质体硼递送系统；该脂肽的肽段含有5个硼苯丙氨酸（boronophenylalanine, BPA）残基，并通过疏水性脂质部分锚定于脂质体膜。方法：制备粒径约100 nm的B5-TAT-脂肽5%脂质体，并评估其对CT26小鼠结肠癌细胞的硼递送。结果：在25 ppm硼暴露浓度下，B5-TAT-脂肽5%脂质体达到约4.5 μg B/1 × 10⁶个细胞的细胞相关硼（cell-associated boron）水平。另外，在50 ppm暴露浓度下评估时，包封巯基十一氢十二硼酸钠（sodium mercaptoundecahydro-closo-dodecaborate, BSH）的B5-TAT-脂肽5%脂质体达到约11 μg B/1 × 10⁶个细胞。热中子照射后，经B5-TAT-脂肽5%脂质体处理的细胞显示克隆形成存活（clonogenic survival）显著下降，照射15和45 min后的存活分数（surviving fraction）分别约为0.12和0.01。在初步体内耐受性（in vivo tolerability）研究中，快速静脉给予不含包封BSH的B5-TAT-脂肽5%脂质体（10 mg B/kg）导致所有处理小鼠在5–10 min内死亡，而给予磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline, PBS）、游离BSH或包封BSH的PEG化脂质体（PEGylated liposomes）后未发生死亡。结论：这些发现证明B5-TAT-脂肽修饰脂质体具有显著的细胞相关硼递送和中子诱导的克隆形成细胞杀伤作用，同时揭示在所考察给药条件下急性体内耐受性存在关键局限。

硼中子俘获治疗（boron neutron capture therapy, BNCT）是依赖¹⁰B在肿瘤细胞选择性积累后经中子照射发生¹⁰B(n,α)⁷Li反应、产生高线性能量转移且短路径粒子的二元放疗。加速器BNCT已在复发或局部晚期头颈癌患者中使用¹⁰B富集硼苯丙氨酸（boronophenylalanine, BPA；borofalan）显示临床可行性，并扩展至新诊断胶质母细胞瘤。其疗效取决于肿瘤内足够高且空间有利的硼分布，同时需限制正常组织暴露；BPA存在肿瘤滞留不足，巯基十一氢十二硼酸钠（sodium mercaptoundecahydro-closo-dodecaborate, BSH）存在肿瘤选择性有限，促使研究人员发展更有效的硼递送策略。脂质体可于水相包封亲水硼化合物、于脂双层嵌入硼共轭脂质或其他两亲性含硼分子，并可通过表面肽功能化调节与靶细胞相互作用、促进细胞关联或内化。既往研究人员开发了含3个或5个BPA残基的B3-TAT-和B5-TAT-脂肽，其中HIV-1转录反式激活因子（transactivator of transcription, TAT）域为富含碱性氨基酸的细胞穿透肽，可通过内吞包括巨胞饮增强分子和纳米载物递送；B5-TAT-脂肽含5个共价BPA残基、TAT域及疏水脂质锚，BPA位于自膜表面延伸的肽段，脂质体内部水相仍可包封BSH。本研究因B5-TAT-脂肽具有更高硼载量而选其进一步评估，旨在表征B5-TAT-脂肽修饰脂质体作为BNCT多功能硼递送平台的潜力与局限，包括理化性质、CT26细胞关联、包封BSH后的细胞相关硼、热中子照射后克隆形成存活及初步体内耐受性。

关键技术方法：以Fmoc固相肽合成制备B5-TAT-脂肽；薄膜水化-100 nm挤出制备5%脂质体，反相蒸发制备BSH包封脂质体并以尺寸排阻色谱（size-exclusion chromatography, SEC）分离；用动态光散射（dynamic light scattering, DLS）、激光多普勒电泳和透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）表征；电感耦合等离子体原子发射光谱（inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy, ICP-AES）测定细胞相关硼；CT26.WT（ATCC CRL-2638，Lot No. 70009864）用于体外实验；在京都大学研究堆（Kyoto University Research Reactor, KUR）重水热中子设施（1 MW）行15/30/45 min照射及克隆形成实验；6周龄雌性BALB/cA小鼠（CLEA Japan）行初步静脉耐受性评估。

结果部分：3.1 B5-TAT-脂肽5%脂质体的理化表征：通过DLS、zeta电位和TEM研究，脂质体Z-average直径为105.9 nm，多分散指数（polydispersity index, PDI）为0.066，强度加权主群为115.2 nm；zeta电位为+18.6 mV，主群+21.0 mV占85.1%；TEM显示约100 nm囊泡；5%为制备时名义摩尔比例，既往报道5 mol%名义添加时脂质体组分掺入效率为66.1%。结论为成功制备表面正电、约100 nm的囊泡型脂质体。3.2 细胞相关硼水平：通过CT26细胞暴露2 h、PBS洗两次后ICP-AES测定，25 ppm下游离BSH和BSH包封裸脂质体细胞相关硼低，B5-TAT-脂肽5%脂质体约4.5 μg B/1 × 10⁶个细胞，显著高于两者（p < 0.0001）；另外，BSH包封B5-TAT-脂肽5%脂质体在50 ppm下约11 μg B/1 × 10⁶个细胞，因暴露浓度不同未作统计比较，不能解释为BSH包封本身提高硼关联效率。3.3 热中子照射后克隆形成细胞杀伤：通过32 ppm硼暴露、15/30/45 min热中子照射（平均热中子注量分别为1.06 × 10¹²、2.65 × 10¹²、3.73 × 10¹² cm^?2；平均非硼物理剂量分别为0.57、1.33、1.65 Gy）及克隆形成实验，B5-TAT-脂肽5%脂质体使存活分数分别降至约0.12、0.03、0.01；双因素ANOVA显示照射时间、配方及交互作用显著，Dunnett检验显示各照射时间均显著低于照射-only、BPA-fructose、游离BSH和BSH包封PEG化脂质体；45 min时Tukey检验亦显著低于各对照。游离BSH因细胞摄取有限而未在照射前洗去，代表细胞外BSH存在的参考条件。结论为清洗后仍与细胞关联的硼足以显著增强中子诱导的克隆形成细胞杀伤。3.4 初步体内耐受性：通过雌性BALB/cA小鼠快速尾静脉推注研究，PBS、游离BSH（10 mg B/kg）和BSH包封PEG化脂质体（10 mg B/kg）组72 h内均无死亡（0/6）；不含包封BSH的B5-TAT-脂肽5%脂质体10 mg B/kg组全部在5–10 min内死亡（6/6），观察到轻度抽搐运动和轻度失禁，死亡发生于安乐死前；机制未确定。BSH包封PEG化脂质体无死亡说明快速死亡并非含BSH脂质体静脉给药的一般后果。结论为该制剂在所考察快速静脉给药条件下急性耐受性差。

讨论部分总结：原文讨论认为，B5-TAT-脂肽5%脂质体的较高细胞相关硼至少部分可能与表面TAT域有关；TAT为高度阳离子性细胞穿透肽，掺入后使颗粒带正电，既往研究显示TAT修饰可增强脂质体与细胞表面蛋白聚糖结合并经内吞途径内化，Fretz et al.直接显示TAT修饰脂质体先结合质膜后进入内体/溶酶体，TAT载物研究亦涉及巨胞饮；但本研究未直接测定硼的胞内定位，所测应解释为细胞相关硼而非 exclusivamente 胞内硼，且硼增加不能仅归因于TAT，因B5-TAT-脂肽自身含5个BPA残基而增加载硼量。该设计将BPA承载肽段展示于膜表面，同时水相可包封BSH；高浓度BSH与磷脂酰胆碱膜直接作用可致脂质体聚集、膜破裂和包封物泄漏，故仅靠提高BSH载量可能受膜稳定性限制，而本架构通过BPA肽域增载仅需疏水锚入脂双层。BSH包封B5-TAT-脂肽5%脂质体在50 ppm下约11 μg B/1 × 10⁶个细胞，高于25 ppm下B5-TAT-脂肽5%脂质体的约4.5 μg B/1 × 10⁶个细胞，但因浓度不同，不能证明BSH包封本身提高细胞关联。热中子照射后清洗仍见显著克隆存活下降，支持与细胞紧密关联的硼对BNCT疗效重要；α粒子和⁷Li核射程与细胞尺度相当，微剂量模拟显示核剂量可随胞内定位变化，不能仅凭总体硼浓度预测生物效应；游离BSH组为细胞外BSH参考而非直接细胞相关递送比较。BPA-fructose和游离BSH作为临床相关参考，BSH包封PEG化脂质体依据Maruyama et al.既往研究；B5-TAT-脂肽5%脂质体在15、30、45 min均显著低于四组对照。体内快速静脉给予B5-TAT-脂肽5%脂质体导致全部小鼠死亡，而PBS、游离BSH和BSH包封PEG化脂质体无死亡，表明与制剂相关，但实验设计不能识别具体因素；正表面电荷可能影响生物相互作用和耐受性，静脉脂质体可诱导急性补体介导的心肺和血流动力学反应，推注较慢输注可能产生更强肺血管反应，但本研究未评估补体激活、心肺反应、血液学变化、聚集和组织病理，机制未定。局限性包括：所测为细胞相关硼而非胞内/亚细胞定位；BSH包封B5-TAT-脂肽5%脂质体与25 ppm配方浓度不同；未测BSH包封效率；急性死亡机制未研究；未直接评估健康细胞毒性、脱靶效应和器官特异性毒性，不能确立系统给药生物相容性或安全性；HPLC纯化后残留合成或纯化组分包括三氟乙酸反离子不能排除；B5-TAT-脂肽5%脂质体与BSH包封PEG化脂质体在表面修饰及硼化学形式和位置上不同；等硼浓度或剂量不确保等脂质或脂肽浓度或剂量；未评估制剂随时间稳定性。未来需研究B5-TAT-脂肽密度、表面电荷、脂质组成、血液相容性和给药速率，并直接评估胞内硼定位和体内生物分布。

研究结论翻译：B5-TAT-脂肽5%脂质体提供了多功能硼递送平台，其中BPA承载脂肽展示于脂质体表面，额外BSH可包封于内部水相。B5-TAT-脂肽修饰在CT26细胞产生显著细胞相关硼水平，并增强热中子照射后的中子诱导克隆形成细胞杀伤。然而，快速静脉给予不含包封BSH的B5-TAT-脂肽5%脂质体（10 mg B/kg）导致所有处理小鼠死亡，揭示在所考察给药条件下急性全身耐受性存在关键局限。进一步优化制剂和给药条件，并阐明急性反应机制，是体内治疗应用前所需。