《Pharmaceutics》：A Comparative Assessment of Smart Nanoselenium Hybrid Plurosomes for Augmenting Repaglinide Delivery Against Breast and Liver Cancer Treatment: D-Optimal Statistical Design, In Vitro Cytotoxicity, Biomarkers Assessment, and In Silico Studies
编辑推荐：
背景/目的：纳米治疗与药物再利用相结合是克服当前癌症治疗耐药性的新兴策略，尤其在乳腺癌（BC）和肝母细胞瘤（HB）中。本研究比较评估了一种经优化设计的智能抗癌纳米硒杂化瑞格列奈（RG）载药普朗尼克囊泡（SHPs）对MDA-MB-231和HepG2细胞系的抗肿瘤
背景/目的：纳米治疗与药物再利用相结合是克服当前癌症治疗耐药性的新兴策略，尤其在乳腺癌（BC）和肝母细胞瘤（HB）中。本研究比较评估了一种经优化设计的智能抗癌纳米硒杂化瑞格列奈（RG）载药普朗尼克囊泡（SHPs）对MDA-MB-231和HepG2细胞系的抗肿瘤效果。方法：采用薄膜水化法制备SHPs，并通过D-最优设计进行优化，考察处方参数包括Pluronic?用量、超声时间和Pluronic?的亲水亲油平衡值对包封率（EE%）、粒径（PS）和Zeta电位（ZP）的影响。结果：最优处方（OP.SHP）表现出高EE%（70.50 ± 1.86%）、理想的纳米尺寸（242.90 ± 13.77 nm）和优异的稳定性（ZP = -66.40 ± 2.12 mV）。OP.SHP的热分析图谱证实了RG的成功包封。体外药物释放曲线显示出pH依赖性行为，在pH 5.5条件下药物释放增强（10小时内达91.29 ± 5.67%），而在pH 7.4条件下的释放速率慢于RG混悬液。MTT实验显示细胞系依赖性的细胞毒性，OP.SHP对MDA-MB-231细胞（IC50 = 107.50 μg/mL）的抗增殖活性强于HepG2细胞（IC50 = 215.40 μg/mL），均优于RG混悬液。此外，细胞周期分析显示在MDA-MB-231细胞中出现S期和G2/M期积累，在HepG2细胞中出现S期积累，表明细胞周期被破坏。进一步地，Annexin-V/PI实验显示在BC细胞中发生凋亡-坏死性细胞死亡，而在HB细胞中主要为凋亡性细胞死亡。值得注意的是，OP.SHP处理显著降低了Bcl-2水平，并显著增加了caspase-3水平。分子对接分析显示RG对AMPK和Bcl-2具有良好的结合亲和力（分别为-8.7和-8.0 kcal/mol）。结论：最后，OP.SHP对两种细胞系均表现出显著的抗肿瘤活性，凸显其作为癌症治疗纳米治疗策略的潜力。
研究背景与目的
癌症的多药耐药性是当前治疗面临的主要挑战，尤其对于全球第二常见的乳腺癌和第三大致死病因的肝癌。近年来，药物再利用成为一种高效低成本的癌症治疗新思路。其中，靶向ATP敏感性钾通道的药物展现出显著的抗肿瘤效应。瑞格列奈作为一种胰岛素促泌剂和KATP通道抑制剂，已被发现对多种癌细胞具有抗癌活性，但其临床应用受限于水溶性差、口服生物利用度低和半衰期短等理化性质缺陷。为解决这些问题，研究人员提出将RG封装于基于Pluronic?的纳米载体中，此类载体不仅可提高药物稳定性、实现缓释，还具备pH响应性递送的智能特性。为进一步增强疗效，研究人员创新性地引入具有强大抗癌活性的硒纳米颗粒，制备了纳米硒杂化的RG载药普朗尼克囊泡。本研究旨在通过D-最优实验设计优化该纳米体系，并首次系统比较其在人三阴性乳腺腺癌细胞和人肝母细胞瘤细胞中的抗肿瘤效果及相关机制，为乳腺癌和肝癌的治疗提供新的纳米治疗策略。
关键技术方法
研究人员采用了D-最优实验设计，利用Design Expert?软件系统优化处方参数。通过薄膜水化法制备纳米硒杂化RG载药普朗尼克囊泡。采用动态光散射技术测定粒径、Zeta电位和多分散系数；透射电子显微镜观察形态；差示扫描量热法和傅里叶变换红外光谱进行理化表征。体外释放实验在不同pH条件下进行。采用MTT法评估细胞毒性；流式细胞术进行细胞周期分析和Annexin-V/PI凋亡检测；酶联免疫吸附试验和化学发光免疫分析法测定生物标志物水平。最后，通过AutoDock Vina进行分子对接模拟分析。
研究结果
3.1 D-最优实验设计分析：通过17次实验运行，建立了各响应变量的数学模型。包封率拟合为两因素交互模型，粒径拟合为二次模型，Zeta电位拟合为线性模型。分析表明，增加Pluronic?用量和超声时间均可显著提高包封率，而高HLB值的Pluronic?混合物更有利于药物包封。粒径随Pluronic?用量增加呈先减小后增大的趋势，而延长超声时间和使用低HLB值则导致粒径增大。Zeta电位绝对值随Pluronic?用量增加而降低，随超声时间延长和高HLB值使用而升高。
3.2 最优处方的选择：基于期望函数法，确定最优处方为40 mg Pluronic? F127/P123混合物、HLB值为15、超声10分钟。该处方表现出高包封率、理想纳米尺寸和优异稳定性，预测值与实测值偏差小于10%，验证了模型的可靠性。
3.3 最优处方的体外表征：透射电镜显示球形、表面光滑、无聚集的形态。差示扫描量热法证实了RG由晶态转变为无定形态的成功包封。傅里叶变换红外光谱确认了物理包封而无化学不相容性。体外释放呈现pH依赖性双相释放模式，在pH 5.5酸性条件下释放更快，在pH 7.4生理条件下释放更缓慢，有利于肿瘤微环境靶向递送。动力学拟合符合Higuchi扩散模型。短期储存稳定性研究表明，90天内各项关键参数无显著变化，表现出良好的胶体稳定性。
3.4 体外细胞毒性评价：MTT实验显示细胞系依赖性细胞毒性。在MDA-MB-231细胞中，OP.SHP的IC50值显著低于RG混悬液，表明抗增殖活性增强了1.53倍。相反，在HepG2细胞中，OP.SHP的IC50值高于RG混悬液。这归因于不同细胞系的代谢差异和摄取能力不同，总体表明乳腺癌细胞对OP.SHP更为敏感。
3.5 细胞周期分析：在MDA-MB-231细胞中，OP.SHP处理导致G0/G1期细胞减少，S期和G2/M期细胞显著增加，尤其是G2/M期增加了32倍，表明硒纳米颗粒诱导的G2/M期阻滞作用。在HepG2细胞中，OP.SHP主要表现为S期积累和G0/G1期减少，这与肝母细胞瘤较强的抗氧化能力限制了G2/M期进展有关。
3.6 凋亡评价：Annexin-V/PI实验揭示了不同的细胞死亡机制。在乳腺癌细胞中，OP.SHP同时诱导凋亡和显著的坏死，总凋亡率为4.45%，坏死率达30.24%，这可能与硒纳米颗粒引起的氧化应激有关。而在肝母细胞瘤细胞中，OP.SHP主要诱导凋亡，总凋亡率达13.86%，坏死率较低。
3.7 生物标志物评价：与RG混悬液相比，OP.SHP在两种细胞系中均更有效地降低了p-AMPK和抗凋亡蛋白Bcl-2的水平，同时显著提高了促炎因子TNF-α和促凋亡执行蛋白caspase-3的水平。这表明OP.SHP通过抑制能量代谢适应、解除抗凋亡保护、激活炎症反应和执行凋亡程序等多重机制发挥抗肿瘤作用。
3.8 计算机模拟研究：分子对接结果显示，RG对AMPK和Bcl-2均具有较强的结合亲和力，结合能分别为-8.7和-8.0 kcal/mol。RG与AMPK的Asp216形成氢键，与多个芳香残基产生π-π相互作用；与Bcl-2的Arg143和Leu134形成氢键，并与关键残基产生疏水接触。这些结果从计算层面支持了RG多靶点调控代谢和凋亡通路的潜力。
讨论与结论
本研究的结论部分指出，该研究成功设计和开发了智能纳米硒杂化普朗尼克囊泡，显著提升了RG的整体治疗效果。该系统表现出pH依赖性药物释放行为，有利于在酸性肿瘤微环境中优先释放药物。OP.SHP对MDA-MB-231细胞显示出更强的细胞毒性，并诱导细胞周期在S期和G2/M期停滞。在乳腺癌细胞中，肿瘤抑制通过凋亡和坏死双重途径介导，而在肝母细胞瘤细胞中则以凋亡为主。OP.SHP处理导致p-AMPK和Bcl-2水平降低，TNF-α和caspase-3水平升高。分子对接分析进一步证实了RG与AMPK和Bcl-2的强结合亲和力。综上所述，这些结果表明OP.SHP通过靶向多条致癌通路展现出强大的抗癌潜力。然而，研究人员也指出，仍需进一步的体内研究、药代动力学和药效学评价来确定所提出制剂的临床转化价值，特别是在剂量优化、生物分布和安全性评估方面。
