基于tKeima的荧光生物传感在饮料中检测金属离子：从缓冲液到食品基质

《Biosensors》：From Buffers to Food Matrices: tKeima-Based Fluorescent Biosensing of Metal Ions in Beverages

　　

金属离子如铁和铜可影响饮料的质量和稳定性，因此需要开发生物传感器。本研究评估了荧光蛋白tKeima作为荧光淬灭平台在饮料基质中筛选Fe²⁺、Fe³⁺和Cu²⁺的适用性。tKeima在软饮料、离子饮料、蔬菜汁、抹茶和牛奶中对所有三种金属离子均表现出浓度依赖的荧光淬灭。对这些饮料的基质效应分析显示，tKeima保留了在缓冲液条件下观察到的约72%–82%的淬灭响应，表明金属响应性荧光在很大程度上得以保留。加标回收分析表明，在饮料基质中可检测到添加的Fe²⁺、Fe³⁺和Cu²⁺，在较高加标浓度下回收率一般约为70%至84%。总体而言，这些发现表明tKeima在复杂饮料基质中保留了可测量的金属响应性荧光淬灭，并为其作为简单荧光平台用于饮料样品中铁和铜离子的一线筛查提供了基础。本研究首次在预处理商业饮料中，对基于荧光蛋白的金属响应传感在真实食品基质中的适用性进行了概念验证评估。

饮料中的过渡金属离子（如铁和铜）可通过原料、加工用水、设备及包装材料进入食品体系，参与氧化还原反应，促进氧化变质，影响色泽、澄清度及风味等感官品质。传统仪器方法如电感耦合等离子体质谱法和原子吸收光谱法虽然具有低检出限和定量限，但依赖专用设备、复杂样品制备及实验室操作，难以满足快速一线筛查需求。荧光方法可作为辅助手段，通过初步判别确定需进一步定量分析的样品。荧光蛋白传感器无需外源辅因子或标记试剂，可利用标准荧光仪器测量信号，且基因编码特性便于生物表达生产。Keima衍生蛋白因斯托克斯位移大，可降低复杂食品基质中光谱重叠与背景干扰。此前研究已表明tKeima在缓冲液、自来水及全细胞体系中可对Fe²⁺、Fe³⁺和Cu²⁺产生浓度依赖性荧光淬灭，但其在真实食品基质中的表现尚未充分验证。因此，本研究旨在评估tKeima基于荧光淬灭的传感平台在饮料基质中一线筛查金属离子的适用性。

研究人员选取了pH与组成不同的商业饮料样本，包括软饮料、离子饮料、蔬菜汁、抹茶和全脂牛奶，均购自韩国晋州当地市场。将饮料经离心和过滤预处理后，将纯化的重组tKeima与饮料基质混合，测定其对Fe²⁺、Fe³⁺和Cu²⁺的浓度依赖性荧光淬灭。通过Langmuir等温线拟合获得表观解离常数（K_d）和最大淬灭响应（B_max）。进一步分析基质效应（与pH匹配缓冲液比较保留响应），并进行加标回收实验。此外还评估了选择性、干扰离子、pH影响及内滤效应。主要技术方法包括：重组tKeima在大肠杆菌中表达并纯化；饮料样品离心（15,000 rpm，15 min）后经0.2 μm滤膜过滤获得基质；荧光测量采用激发450 nm、发射617 nm，使用黑色96孔板和荧光微板读取器；利用Langmuir等温线模型（GraphPad Prism 10.0）拟合滴定数据；通过pH匹配缓冲液计算相对淬灭响应与信号抑制；加标浓度设为200、1000和2000 μM，根据校准曲线计算回收率；所有实验重复三次，采用单因素方差分析。

研究结果分为以下三个部分：

**3.1 饮料基质中tKeima的金属响应淬灭**

通过浓度依赖性滴定实验，研究人员发现tKeima在软饮料、离子饮料、蔬菜汁、抹茶和牛奶中对Fe²⁺、Fe³⁺和Cu²⁺均呈现出浓度依赖性荧光淬灭，且未观察到可见沉淀，OD₇₀₀值低于0.1，表明无显著浊度干扰。Langmuir等温线拟合显示，表观K_d值范围：Fe²⁺为849.7–1124 μM，Fe³⁺为935.5–1018 μM，Cu²⁺为651.4–752.1 μM；对应B_max分别为81.89%–89.36%、78.42%–86.14%和89.95%–94.57%。与缓冲液条件相比，饮料基质通常产生较低的表观K_d和降低的B_max，说明基质成分改变了淬灭的浓度依赖性和最大程度，但保留了金属响应能力。光谱测量显示，饮料基质未诱导显著的荧光发射峰位移，金属处理后主要引起荧光强度下降而峰形基本保持；吸收光谱未发现明显内滤效应。选择性实验表明，Hg²⁺、Pb²⁺和Cd²⁺单独存在时几乎不引起淬灭，也不干扰Fe²⁺、Fe³⁺和Cu²⁺的淬灭响应。但在三种目标金属共存时，由于淬灭程度相似且无特征光谱位移，单一荧光强度读数无法区分具体金属种类，因此tKeima更适合作为一线筛查平台而非金属特异性识别工具。

**3.2 基质效应对tKeima金属离子响应的影响**

为排除pH影响，研究人员使用pH匹配缓冲液作为参考，计算相对淬灭响应和信号抑制。结果显示，Fe²⁺的相对淬灭响应为72.94%–79.86%，信号抑制为20.14%–27.06%；Fe³⁺为73.40%–82.31%，抑制17.69%–26.60%；Cu²⁺为72.10%–79.30%，抑制20.70%–27.90%。离子饮料对三种金属离子均表现出最强的信号抑制，可能源于电解质干扰；蔬菜汁（对Fe²⁺、Fe³⁺）和牛奶（对Cu²⁺）的抑制最低。总体而言，tKeima在饮料基质中保留了约70%–80%的pH匹配缓冲液淬灭响应，表明基质虽然部分抑制，但未消除金属响应。将离子饮料和蔬菜汁稀释后，相对淬灭响应增加2%–6%，进一步证实抑制源于基质成分。与文献中催化酶电化学生物传感器在自来水中的表现（保留88.5%缓冲响应）相比，tKeima在饮料中保留72.10%–82.31%的响应，仍能提供清晰可测的金属响应信号。

**3.3 加标回收分析**

加标回收实验用于评估tKeima在真实基质中检测已知添加量金属的能力。在五种饮料基质中，Fe²⁺在100–2000 μM范围内回收率分别为软饮料75.0%–92.8%、蔬菜汁73.5%–87.6%、抹茶73.0%–88.3%、离子饮料73.2%–103.6%、牛奶74.1%–96.4%；在500–2000 μM较高范围内，回收率趋于一致，为73.0%–81.1%。Fe³⁺在100–2000 μM范围内回收率为软饮料81.2%–89.5%、蔬菜汁82.0%–88.5%、抹茶80.3%–83.3%、离子饮料72.6%–85.9%、牛奶77.9%–85.5%；在500–2000 μM范围内为72.6%–83.9%。Cu²⁺在软饮料和蔬菜汁中100–2000 μM回收率分别为75.0%–79.5%和74.0%–79.5%，而抹茶、离子饮料和牛奶在100 μM时回收率偏高，500–2000 μM时回收率为70.1%–80.1%。较低加标浓度下回收率波动较大，较高浓度下更稳定。回收率与基质效应分析中约70%–80%的保留响应一致，进一步验证tKeima在饮料基质中可测量且浓度响应的荧光信号。虽然100 μM时仍可观察到约10%–15%淬灭，但U.S. EPA对Fe和Cu的二级标准（5.4 μM和15.7 μM）远低于本研究检测范围，因此tKeima尚不具备痕量合规监测灵敏度，其价值在于快速一线筛查异常升高的金属水平，识别需进一步仪器确认的样品。

在讨论部分，研究人员指出，饮料基质成分可能部分干扰金属与tKeima的相互作用或淬灭过程，但简单稀释可部分缓解基质抑制，无需专门预处理。与已报道的金属离子生物传感器相比，tKeima在复杂饮料基质中的响应保留率虽略低于水体系，但仍保持清晰信号，支持其荧光筛查应用的可行性。研究同时强调了本方法的定位为一线筛查，而非替代确证性仪器分析。

研究结论可翻译为：在本研究中，研究人员评估了tKeima作为荧光平台在饮料中进行一线金属离子筛查的适用性。值得注意的是，tKeima在测试的饮料样品中保留了对Fe²⁺、Fe³⁺和Cu²⁺的浓度依赖性荧光淬灭，维持了在pH匹配缓冲液条件下观察到的约70%–80%的淬灭响应。加标回收分析进一步表明，在饮料基质中可以检测到添加的金属离子，回收率与保留的淬灭响应一致。总体而言，这些结果表明tKeima在饮料样品中提供了可测量的金属响应荧光信号。此外，这些发现支持tKeima作为简单荧光平台用于真实食品样品中一线金属离子筛查的潜力。总之，本研究首次概念验证了基于荧光蛋白的金属响应传感可以扩展到传统缓冲液系统之外的预处理商业饮料基质。