人参皂苷Rd防治心肌梗死后心力衰竭的机制：网络药理学联合体内外实验验证

《Drug Design, Development and Therapy》：Mechanism Study of Ginsenoside Rd in the Prevention and Treatment of Post-Myocardial Infarction Heart Failure: Network Pharmacology Combined with in vivo and in vitro Experiments Verification

　　

目的：本研究旨在探讨人参皂苷Rd（Ginsenoside Rd, GSRd）——人参（Panax ginseng C.A. Mey）的活性成分——对抗心肌梗死后心力衰竭（post-myocardial infarction heart failure, post-MI HF）的免疫保护机制，特别关注其对调节性T细胞（regulatory T cells, Tregs）和单核细胞/巨噬细胞（monocytes/macrophages, Mos/Mφs）的调节作用。

材料与方法：采用超高效液相色谱-串联质谱（ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS）鉴定GSRd。通过左前降支（left anterior descending, LAD）结扎建立小鼠post-MI HF模型，观察GSRd介导的Tregs、白细胞介素-10（interleukin-10, IL-10）和Mos/Mφs变化。网络药理学预测GSRd抗post-MI HF的核心靶点。单细胞虚拟敲除评估靶点功能，蛋白质-蛋白质对接预测IL-10与核心靶点的结合区域。体外实验中，应用脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激的RAW264.7巨噬细胞建立炎症模型，以外源性IL-10作为阳性对照，并使用Stattic对GSRd进行功能反向验证。

结果：UPLC-MS/MS确认了人参中的GSRd。GSRd改善了post-MI HF小鼠的心脏功能并减轻了心肌纤维化。免疫学上，GSRd促进了衰竭心肌和外周循环中Tregs的募集，并升高了IL-10的表达。此外，GSRd促进Mos/Mφs向抗炎性Ly6C^low表型极化（CD206和Arg1上调），抑制促炎性Ly6C^high极化，并减少了TNF-α的分泌。在心脏单核/巨噬细胞中预测STAT3的扰动，提示STAT3作为维持心脏炎症平衡和免疫稳态的关键调节因子。蛋白质-蛋白质相互作用分析预测了IL-10与STAT3之间的结合域；分子对接预测人参皂苷Rd能稳定结合Foxp3、IL-10和STAT3。体外实验表明，GSRd促进STAT3磷酸化，诱导RAW264.7巨噬细胞向抗炎表型极化，而Stattic减弱了GSRd的保护作用。

结论：本研究证明GSRd通过调节心脏免疫微环境对post-MI HF发挥治疗作用。

心肌梗死（myocardial infarction, MI）是危及生命的急性心血管事件，其长期并发症心肌梗死后心力衰竭（post-myocardial infarction heart failure, post-MI HF）发病率高、预后差。全球心力衰竭患者超过6430万，post-MI HF六个月死亡率达23.3%，约30%的MI患者在5年内发展为post-MI HF。该病的病理过程涉及心脏重塑、炎症与免疫功能障碍的复杂交互，其中免疫系统异常激活和免疫细胞亚群失衡是关键环节。调节性T细胞（regulatory T cells, Tregs）通过分泌白细胞介素-10（interleukin-10, IL-10）等抗炎因子维持免疫稳态，但在post-MI HF阶段，心肌组织内Tregs数量减少、功能受损。单核细胞/巨噬细胞（monocytes/macrophages, Mos/Mφs）是心肌损伤后主要的免疫细胞，可分为促炎性Ly6C^high和抗炎性Ly6C^low亚型；post-MI HF中Ly6C^high过度蓄积而Ly6C^low募集不足，驱动持续炎症与心脏功能障碍。IL-10/STAT3信号通路是Tregs调节Mos/Mφs极化的重要桥梁。人参皂苷Rd（Ginsenoside Rd, GSRd）是人参（Panax ginseng C.A. Mey）的标志性活性成分，具有抗炎、心脏保护作用，但其对Tregs和Mos/Mφs的免疫调节机制尚不清楚。因此，本研究整合网络药理学、分子对接、单细胞转录组分析和体内外功能实验，系统探究GSRd治疗post-MI HF的作用机制。

研究人员利用UPLC-MS/MS鉴定人参中GSRd，通过左前降支（left anterior descending, LAD）结扎建立post-MI HF小鼠模型，发现GSRd能改善心脏收缩功能（左心室射血分数LVEF和短轴缩短率FS）、减轻心肌纤维化和病理损伤。免疫学分析显示，GSRd促进Tregs在外周循环和衰竭心肌中的募集，上调Foxp3和IL-10表达；同时GSRd促进Mos/Mφs向抗炎Ly6C^low表型极化，上调CD206、Arg1，抑制促炎Ly6C^high及TNF-α、IL-6等炎症因子。网络药理学预测并验证STAT3为GSRd的核心靶点；单细胞虚拟敲除和体外实验支持STAT3是GSRd调节巨噬细胞极化的关键。该研究为GSRd通过调节心脏免疫微环境治疗post-MI HF提供了证据，也为中药人参的心血管应用奠定了现代药理学基础。

关键技术方法概括：本研究采用UPLC-MS/MS鉴定人参化学成分；用LAD结扎术建立post-MI HF小鼠模型，随机分组并给药4周。网络药理学从多个数据库预测GSRd与MI/HF共有靶点，STRING/Cytoscape构建蛋白互作网络，KEGG富集分析。分子对接（AutoDock Vina）评估GSRd与Foxp3、IL-10、STAT3的结合；AlphaFold3与PRODIGY预测IL-10与STAT3相互作用。单细胞转录组数据（GSE145154，来自阜外医院，已获伦理批准及患者知情同意）经Seurat处理，scTenifoldKnk模拟STAT3在Mos/Mφs中的虚拟敲除。体外用LPS刺激RAW264.7巨噬细胞，IL-10阳性对照，Stattic抑制剂进行功能验证；通过超声、组织染色、流式、免疫荧光和Western blot评估。

研究结果部分：

**人参皂苷Rd指纹图谱分析**：通过UPLC-MS/MS在人参提取物中鉴定出GSRd，保留时间4.3048 min，前体离子946.5501 Da，并与其他主要人参皂苷共存。

**GSRd改善post-MI HF小鼠心脏功能**：超声显示GSRd显著提高LVEF和FS，HE染色显示减轻心肌结构紊乱和炎症浸润，高剂量效果与CD28-SA相当。

**GSRd抑制post-MI HF小鼠心肌纤维化**：Masson和Sirius red染色显示GSRd减少胶原体积分数，高剂量抗纤维化效果与CD28-SA相当。

**GSRd促进Tregs募集和IL-10表达**：流式显示GSRd降低CD45⁺炎症白细胞和CD3⁺CD4⁺ T细胞比例，增加CD25⁺Foxp3⁺ Tregs；免疫荧光和Western blot显示Foxp3⁺IL-10⁺双阳性细胞和IL-10蛋白水平恢复；分子对接显示GSRd与Foxp3（-7.94 kcal/mol）和IL-10（-8.33 kcal/mol）高亲和结合。

**GSRd促进Ly6C^low Mos/Mφs极化并减轻心脏炎症**：流式显示GSRd降低Ly6C^high比例、升高Ly6C^low比例；免疫荧光显示GSRd上调CD206、Arg1，下调CD86、TNF-α和IL-6。

**STAT3是GSRd治疗post-MI HF的核心靶点**：网络药理学得到114个共有靶点，PPI网络和拓扑分析显示STAT3为hub，KEGG富集相关通路；分子对接显示GSRd与STAT3结合亲和力-8.03 kcal/mol。

**IL-10与STAT3蛋白-蛋白相互作用分析**：蛋白质对接预测结合自由能为-13.6 kcal/mol，界面含2个疏水作用、14个氢键和4个盐桥，关键残基包括STAT3的Tyr705等。

**STAT3介导的炎症和免疫稳态调节**：对GSE145154数据的5,872个Mos/Mφs进行虚拟STAT3敲除，STAT3扰动最显著，富集到TNF-α/NF-κB信号通路，提示STAT3是心脏髓系细胞炎症和免疫稳态的核心调控因子。

**GSRd激活STAT3信号诱导RAW264.7巨噬细胞抗炎极化**：体外LPS刺激降低p-STAT3，GSRd剂量依赖性恢复p-STAT3并上调CD206、下调CD86，与IL-10类似。

**Stattic抑制STAT3减弱GSRd的调节作用**：STAT3特异性抑制剂Stattic逆转GSRd对p-STAT3、CD206的上调和CD86的下调，验证了GSRd作用的STAT3依赖性。

讨论部分，研究人员结合中医理论认为post-MI HF属“胸痹”“真心痛”范畴，气虚为本、血瘀为标，人参补气活血，GSRd的心脏保护作用与中医功效相符。Tregs和Mos/Mφs是post-MI HF的重要治疗靶点；IL-10/STAT3轴是Tregs与Mos/Mφs互作的关键。单细胞虚拟敲除和体外实验支持STAT3作为核心枢纽。研究局限性包括未建立Tregs与Mos/Mφs共培养体系、缺少Tregs清除阴性对照、仅研究GSRd、未系统评估剂量-反应关系与口服生物利用度低等。结论部分翻译为：本研究提示GSRd促进Tregs募集和IL-10表达，同时激活Mos/Mφs中的STAT3信号，促进其向抗炎性Ly6C^low亚型极化，并阻断其向促炎性Ly6C^high亚型分化，从而改善心脏功能障碍和心肌重塑，治疗post-MI HF。