Notch信号调控小鼠切牙上皮旋转及唇-舌不对称形态发生中的差异增殖与细胞周期动力学

《Cells》：Notch Signalling Controls Differential Proliferation During Rotation and Asymmetric Morphogenesis of Mouse Incisors

　　

啮齿类切牙表现出显著的唇-舌不对称（labial–lingual asymmetry），釉质仅沉积于唇侧表面，而牙骨质沉积于舌侧表面。该不对称在发育早期即出现，表现为初始对称的牙上皮沿颌骨轴旋转并重新定向。在此，研究人员研究了该过程的细胞和分子机制。对上皮旋转前和旋转期间的定量细胞周期分析及转录组分析显示，与舌侧上皮相比，唇侧上皮增殖加速、细胞周期持续时间缩短，并且DNA复制（DNA replication）和丝分裂基因富集。进化上保守的Notch信号通路是细胞增殖和命运调控因子，在此期间呈不对称活性，其中Notch2表达局限于唇侧区域。谱系追踪（lineage tracing）显示，表达Notch2的细胞及其子代优先贡献于釉质形成区室。上皮特异性缺失Notch2未产生明显的早期形态学表型，并诱导其他Notch通路组分上调。相比之下，药理学Notch抑制（pharmacological Notch inhibition）降低了上皮不对称性并改变S期（S-phase）进程，同时降低Ccnd1和Cdk6表达。总之，这些发现提示Notch信号参与小鼠切牙早期不对称形成过程中的区域细胞周期动力学，同时提示其他Notch组分可能代偿Notch2缺失。

研究背景方面，啮齿类切牙具有持续生长和显著唇-舌不对称的特征，釉质仅位于唇侧、牙骨质位于舌侧；该不对称在胚胎早期由初始对称的上皮芽沿颌骨轴旋转并形成唇、舌区室而建立。尽管切牙发育的形态学过程已被较充分描述，但驱动不对称上皮生长的细胞和分子机制仍不清楚。Notch信号通路是进化上保守的增殖、分化和命运决定调控通路，且多个Notch通路组分在切牙上皮旋转前呈不对称表达，但其是否在切牙形态发生中功能性调控不对称生长尚不明确。因此，研究人员结合定量形态测量、细胞周期分析、转录组分析以及遗传和药理学扰动，研究小鼠下颌切牙早期形态发生。结果表明，上皮细胞周期动力学的区域差异促进唇侧扩张和切牙不对称；Notch2单独缺失未产生明显早期表型，而药理学Notch抑制降低唇-舌面积差并改变累积EdU掺入。该研究提示Notch信号是切牙上皮不对称的关键调控者，但未证明同一机制适用于其他牙齿或附属器。

关键技术方法概括（不超过250字）：研究人员使用E12.5–E14.5小鼠胚胎下切牙，包括C57BL/6J野生型及Keratin14^Cre/+;Notch2^fl/fl、Keratin14^Cre/+;R26^mT/mG、Notch2-CreERT2^/+;R26^mT/mG品系；离体培养取E12.5–E13下颌，每个胚胎仅取一个下切牙并作为独立生物学重复。主要方法包括全mount免疫荧光与定量形态测量、双EdU/BrdU脉冲追踪、累积EdU标记、Ki67和PH3免疫染色、激光捕获显微切割（laser capture microdissection, LCM）联合bulk RNA测序（RNA-seq）、RT-qPCR、Notch2-CreERT2谱系追踪、上皮特异性Notch2条件性缺失及CB103药理学抑制。

研究结果：3.1 上皮唇-舌不对称在切牙发育早期出现。研究人员通过E13–E14全mount成像和上皮面积、总细胞数定量发现，E13上皮为对称上皮芽，E13.5出现唇-舌不对称的最早形态学迹象，E14唇、舌颈环清晰可分；唇侧生长在E13.5–E14显著增加，而舌侧参数基本不变，提示定向上皮扩张早期启动且具有唇侧特异性。3.2 差异细胞周期动力学驱动上皮不对称。双EdU/BrdU脉冲追踪显示，短BrdU脉冲在唇、舌上皮标记比例相近，Ki67结果一致；24 h后唇侧EdU标记细胞少而舌侧多数保留标记，PH3显示唇侧丝分裂活动更高。累积EdU标记显示唇侧较早达到平台、舌侧延迟，提示唇侧细胞周期进展更快；aphidicolin处理使外植体停滞于芽期，说明DNA复制是培养条件下正常发育进程所需，但该实验未分离增殖在不对称建立中的特定作用。3.3 转录变化伴随唇-舌不对称建立。对E13–E13.5激光捕获的唇、舌上皮进行bulk RNA-seq，E13前后部比较未发现显著差异表达基因（DEGs）；E13.5鉴定出18个唇-舌DEGs，Foxi3、Lef1和Wnt10b在舌侧较高；E13至E13.5过渡中唇侧449个基因、舌侧17个基因表达改变，仅8个共享，提示多数变化具有区室特异性。3.4 唇侧特异性细胞周期动力学和Notch2谱系限制驱动上皮不对称。唇侧DEGs的ridge plot显示DNA复制和细胞周期进展相关基因在E13至E13.5间明显偏移；GSEA显示E13唇侧富集G₂/M转换和S期进程通路，唇侧较舌侧在E13–E13.5更强富集丝分裂纺锤体和G₂/M转换；Notch信号也见于唇侧特异性通路。Notch2-CreERT2^/+;R26^mT/mG谱系追踪显示，E13切牙经4-OHT诱导后24 h，Notch2表达细胞及子代主要位于唇侧上皮基底和基底上层层，48 h仍局限于发育中唇侧颈环的基底和基底上层层；该模式与Notch2在E13.5主要位于唇侧、E14.5向舌侧扩展的免疫组化结果一致，提示Notch2表达细胞标记并贡献于扩张中的唇侧区域。3.5 上皮Notch2缺失改变Notch通路组分表达。Keratin14^Cre/+;Notch2^fl/fl（K14;Notch2）突变体在E13–E14.5未见明显形态差异，E13和E13.5增殖未受影响；但bulk RNA-seq的GSEA显示Notch信号调控峰重叠，RT-qPCR显示突变上皮中Notch1显著上调，Jag1、Dll1及经典Notch靶基因Hes1、HeyL、Hey1、Hey2上调，Jag2降低，Hes5不变，提示其他Notch受体或通路串扰可能缓冲Notch扰动效应。3.6 药理学抑制Notch信号破坏增殖不对称。E13 Keratin14^Cre/+;R26^mT/mG切牙外植体经CB103或DMSO处理48 h，CB103处理组缺乏对照中的不对称上皮生长，唇-舌面积差显著降低；E12.5外植体预培养12 h后累积EdU标记1–6 h，初始标记比例不受影响，但CB103处理唇侧EdU掺入增加延迟，舌侧在处理后保持稳定；RT-qPCR显示CB103显著降低Ccnd1和Cdk6，而Cdk4不变，提示Notch信号可能通过Ccnd1和Cdk6调控唇侧细胞周期进展。

讨论部分总结：研究人员认为，切牙定向生长并非源于增殖细胞比例差异，而源于细胞周期动力学的区域差异；唇侧上皮细胞周期进展约为舌侧两倍，驱动唇侧优先扩张和芽至帽期上皮旋转。转录组提示唇侧富集DNA复制、G₂/M进展和丝分裂纺锤体组装相关基因，说明细胞周期时序调控是组织生长动态和上皮不对称出现的关键决定因素。与仅分析基底上皮细胞的研究不同，该研究量化了整个牙上皮区室的细胞周期动态。差异表达基因包括Lef1、Foxi3、Wnt10b及Hoxa6、Hoxc6、Hoxc8等，提示不对称建立不仅涉及细胞周期调控，也涉及上皮身份和发育模式。Notch2在旋转前不对称分布，谱系追踪显示其表达细胞优先贡献于唇侧区域，药理学Notch抑制使唇、舌生长趋于均等并呈更似磨牙形态，同时下调G₁/S期调控因子Ccnd1和Cdk6，提示局部Notch活性与细胞周期控制之间存在可能联系。研究人员指出，Notch抑制表型较Shh抑制更选择性地影响上皮不对称，但该研究未确定Notch与Shh的上下游或直接互作关系；Notch在进化中参与组织不对称，但数据未证明其他附属器采用相同机制。上皮特异性Notch2缺失未复制药理学抑制表型，而伴随Notch1、Jag1、Dll1、Hes1、Hey1、Hey2等上调，提示Notch信号网络存在代偿和冗余；Notch2缺失后期可导致出生后切牙缩短及上皮完整性和釉质形成缺陷，早期其他Notch信号可能代偿。该研究还提示这些发现对再生医学、组织工程及Notch信号和增殖控制相关上皮疾病机制研究具有启示。

研究结论翻译：该研究证明，不对称切牙生长由唇侧和舌侧上皮之间细胞周期动力学的区域差异驱动。研究人员将Notch信号鉴定为该过程的重要调控者，将空间模式与增殖行为联系起来。药理学Notch抑制后细胞周期调控因子Ccnd1和Cdk6表达降低，进一步支持Notch活性与细胞周期调控之间的关联。此外，上皮特异性Notch2缺失后其他Notch通路组分上调，提示存在代偿网络，可能维持定向上皮生长和正常形态发生。更广泛地，这些发现为理解保守信号通路如何将分子不对称转化为组织结构提供了框架，该原则可能适用于多种外胚层附属器。