B2M基因敲除联合海藻酸盐微胶囊封装降低iPSC来源胰腺祖细胞免疫排斥的研究

《Cells》：Combined B2M Knockout and Alginate Encapsulation Reduces Immune Rejection of iPSC-Derived Pancreatic Progenitors

　　

摘要专业翻译 基于诱导多能干细胞（iPSC）来源胰腺祖细胞（PPs）的同种异体细胞替代疗法治疗糖尿病，目前受限于免疫排斥反应。海藻酸盐封装与通过β2-微球蛋白（B2M）基因敲除实现的HLA-I类分子遗传消融，是减少免疫识别并保护移植细胞的两种不同策略。研究人员制备了封装型B2M基因敲除胰腺祖细胞（IPS-?B2M-PPs），并通过外周血单个核细胞（PBMC）共培养、自然杀伤细胞（NK细胞）脱颗粒、T细胞活化及大鼠巨噬细胞黏附等体外实验评估其免疫原性。此外，通过将微胶囊移植入大鼠大网膜，开展了体内研究以评估胶囊生物相容性与结构稳定性。虽然B2M基因敲除未损害向胰腺谱系的分化能力，但封装在很大程度上阻止了NK细胞脱颗粒，且与所封装的细胞类型无关；不过，在与封装祖细胞共培养7天后，T细胞仍表现出残余活化，尽管其水平较非封装对照组显著降低。与野生型祖细胞相比，含IPS-?B2M-PP的胶囊在体外表现出减少的巨噬细胞黏附，而巨噬细胞分泌的白细胞介素-1β（IL-1β）仍可忽略不计。在体内，所有胶囊均形成肌成纤维细胞带，且未见巨噬细胞异物巨细胞；IPS-?B2M-PP植入物表现出最薄的纤维化囊壁和最低程度的淋巴细胞浸润。在2周及1个月时均未观察到胶囊变形，表明其结构稳定性得以保持。尽管该研究表征了生物材料周围的局部组织反应及胶囊稳定性，但并未确立封装细胞在体内的免疫逃逸或免疫原性降低。总体而言，本研究证明了将B2M基因敲除与海藻酸盐封装相结合的可行性，并提示在胶囊完整性受损的情况下，B2M缺失可能具有额外的保护作用，这有待进一步研究。

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一、研究背景与问题

1型糖尿病（T1DM）的根治性治疗策略中，基于诱导多能干细胞（iPSC）来源的细胞替代疗法展现出巨大前景。通过体外定向分化获得的功能性β细胞可恢复生理性胰岛素分泌，从根本上解决绝对胰岛素缺乏的问题。然而，同种异体移植面临两大免疫屏障：以T细胞识别供体人类白细胞抗原（HLA）分子为核心的适应性免疫，以及自然杀伤（NK）细胞通过“缺失自我”机制攻击缺乏自身HLA-I类表面肽段细胞的固有免疫。即使HLA配型相合，次要组织相容性抗原仍可触发排斥反应，迫使患者长期接受免疫抑制治疗，并伴随显著副作用。

为规避T细胞识别，一种直接策略是敲除编码β2-微球蛋白（B2M）的基因——B2M是所有HLA-I类分子细胞表面表达所必需的亚基，B2M缺陷细胞因此缺乏HLA-I类分子呈递，从而对CD8?T细胞“隐身”。但消除HLA-I类分子同时引发新问题：NK细胞通过抑制性杀伤免疫球蛋白样受体（KIRs）识别自身HLA-I类分子，缺乏HLA-I的细胞被识别为异常并遭溶解。此外，iPSC来源细胞会上调激活配体（如MICA、PVR、NECTIN2）并丢失抑制信号，进一步增加对NK细胞攻击的敏感性。

替代或互补策略是海藻酸盐封装——利用生物相容性聚合物在移植细胞与宿主免疫细胞间建立物理屏障，阻止T细胞、NK细胞和巨噬细胞的直接接触，同时允许氧气、营养物质和胰岛素的扩散。然而，封装细胞的临床应用主要受限于异物反应（FBR），该反应级联导致纤维化过度生长、物质传递受损及移植物最终丢失。此外，封装本身不能消除抗原脱落或间接免疫识别，胶囊自身也可能引发炎症反应。

因此，将B2M基因敲除（消除直接CD8?T细胞识别）与海藻酸盐封装（物理阻断免疫效应细胞接触，包括NK细胞）相结合，构成双重机制策略。该策略可规避多基因编辑的复杂性，同时应对免疫系统的两大分支。尽管B2M敲除细胞已在非封装形式下被研究，海藻酸盐封装也已与野生型细胞联合测试，但封装型B2M敲除iPSC来源胰腺祖细胞的联合效力此前尚未在受控的同种异体共培养系统中得到评估。物理封装能否补偿B2M缺陷细胞的NK细胞易感性仍是未知数。为此，研究人员开展了本研究。

二、研究内容与主要结论

研究人员生成了封装型B2M基因敲除胰腺祖细胞（IPS-?B2M-PPs），通过外周血单个核细胞（PBMC）共培养、NK细胞脱颗粒、T细胞活化及大鼠巨噬细胞黏附等体外实验评估其免疫原性，并通过将胶囊移植入大鼠大网膜开展体内研究，评估胶囊生物相容性与结构稳定性。研究得出以下主要结论：B2M基因敲除未损害向胰腺谱系的分化能力；封装可完全阻止NK细胞脱颗粒，与所封装细胞类型无关；T细胞在7天共培养后仍存在残余活化，但显著低于非封装对照组；IPS-?B2M-PP胶囊的巨噬细胞黏附减少，IL-1β分泌可忽略；体内所有胶囊均形成肌成纤维细胞带，未见异物巨细胞，IPS-?B2M-PP植入物的纤维化囊壁最薄、淋巴细胞浸润最少，且胶囊结构稳定性保持良好。该研究证明了B2M基因敲除与海藻酸盐封装相结合的可行性，并提示在胶囊完整性受损时B2M缺失可能具有额外保护作用。

三、主要关键技术方法

研究人员使用了以下关键技术方法：利用商业化的STEMdiff?胰腺祖细胞分化试剂盒，将iPSC系RCPCMi007-A-1和RCPCMi007-A及B2M敲除的IPS-?B2M细胞系定向分化为胰腺祖细胞，其中定型内胚层阶段延长2天；采用定制微流控装置制备核-壳结构海藻酸盐微胶囊，核心为海藻酸盐水凝胶，覆以半渗透性PMETAC:NVP共聚物膜及额外薄海藻酸层；通过流式细胞术检测HLA-A、B、C表达及CXCR4、PDX1、NKX6.1等标志物；使用FITC标记凝集素（分子量36–150 kDa）评估胶囊渗透性；采用Live/Dead双染法结合共聚焦显微镜评估封装后细胞活力；通过大鼠腹腔巨噬细胞共培养评估巨噬细胞黏附与IL-1β分泌；利用健康供体外周血单个核细胞（PBMC）进行NK细胞脱颗粒（CD107a）和T细胞活化（CD69、CD25）检测；体内实验将微胶囊移植入Wistar大鼠大网膜，于2周和1个月时间点取材，采用苏木精-伊红（H&E）染色、Masson三色染色及αSMA和Iba-1免疫组化染色进行组织学评估。样本来源包括6名健康供体用于NK细胞检测，4名用于7天T细胞检测，2名用于24小时T细胞检测。

四、研究结果

4.1 B2M敲除iPS细胞向胰腺细胞的分化

研究人员将未编辑和编辑的细胞系（分别为IPS和IPS-?B2M）分化为胰腺祖细胞（IPS-PPs和IPS-?B2M-PPs）。分化第5天，超过98%的细胞呈定型内胚层标志物CXCR4阳性。第16天，两种细胞系均表达胰腺祖细胞标志物PDX1、NKX6.1和MAFA，且胰岛素、胰高血糖素和生长抑素等胰腺基因表达较未分化iPSC增加。野生型与B2M敲除细胞在胰腺祖细胞诱导阶段的标志物阳性细胞百分比无显著差异。

4.2 iPSC来源胰腺祖细胞中的HLA-I表达

分化第16天，非敲除IPS-PP细胞系中HLA-I阳性细胞比例增至40%，而B2M敲除的IPS-?B2M-PP细胞未观察到抗原表达，证实B2M敲除有效消除了HLA-I类分子表面表达。

4.3 海藻酸盐微胶囊制备与表征

微胶囊平均直径为235–270 μm，多分散指数（PDI）为0.034–0.070，表明粒径分布窄。在HBSS、完全培养基和胎牛血清中孵育24小时，所有胶囊类型均保持尺寸稳定，无明显溶胀或收缩。渗透性测试显示，36 kDa凝集素可自由穿透，120 kDa和150 kDa凝集素被有效阻断，表观渗透阈值介于75–120 kDa之间，符合免疫隔离要求。封装后24小时，成纤维细胞活力为93.4±5.3%，而IPS-PP和IPS-?B2M-PP祖细胞活力分别为53.0±22.8%和57.5±16.4%，细胞簇内细胞活力高于单个分散细胞。

4.4 微胶囊生物相容性评估

体外巨噬细胞黏附实验中，空胶囊基线黏附为1.28±1.00个细胞/胶囊；含IPS-PP和成纤维细胞的胶囊显著增加巨噬细胞附着（分别为2.32±1.88和2.76±1.78个细胞/胶囊）；含IPS-?B2M-PP的胶囊黏附显著减少（1.47±1.24个细胞/胶囊），与空胶囊无显著差异。所有实验组的IL-1β分泌水平均保持极低，与未处理对照组无显著差异。体内移植后，所有胶囊周围均形成内层肌成纤维细胞带和外层含成熟胶原、毛细血管及淋巴细胞浸润的纤维化区，未见多核异物巨细胞，胶囊表面Iba-1巨噬细胞染色阴性。含成纤维细胞的胶囊诱导最强烈的反应，纤维囊壁最厚、淋巴细胞密度最高；IPS-PP胶囊反应较轻；IPS-?B2M-PP胶囊反应最弱，肌成纤维细胞带最薄、淋巴细胞浸润最少，1个月时仍无胶囊变形。

4.5 人免疫细胞反应

NK细胞脱颗粒实验中，所有非封装培养物（成纤维细胞、IPS-PPs、IPS-?B2M-PPs）均诱导显著脱颗粒，响应水平分别为K562阳性对照的34±7%、37±14%和48±14%，其中IPS-?B2M-PPs诱导的脱颗粒显著高于IPS-PPs。所有封装形式（含成纤维细胞、IPS-PPs、IPS-?B2M-PPs的胶囊及空胶囊）均未显著增加脱颗粒NK细胞比例（6–9%），表明封装完全阻止了NK细胞活化。T细胞活化实验中，24小时检测时，仅非封装IPS-PPs诱导显著T细胞活化（为未刺激对照的7.5倍），非封装IPS-?B2M-PPs的响应约为17倍，而所有封装变体均处于背景水平。7天检测时，非封装成纤维细胞诱导3.6±1.6倍活化，非封装IPS-PPs和IPS-?B2M-PPs分别诱导6.8±0.6倍和7.4±1.3倍活化；封装显著降低但未完全消除T细胞活化，封装IPS-PPs和IPS-?B2M-PPs分别诱导2.7±1.1倍和2.5±0.6倍活化，均显著高于未刺激对照但显著低于对应非封装培养物。

五、讨论与结论

讨论部分指出，封装在阻止NK细胞脱颗粒方面提供了主要保护，而B2M缺失在完整胶囊存在下未额外降低T细胞活化。残余T细胞活化表明当前方法未提供完全免疫保护。研究人员提出几种可能机制解释NK与T细胞对封装的敏感性差异：胶囊机械损伤导致少量祖细胞逃逸并与免疫细胞直接接触；T细胞可通过TCR非依赖性途径（如NKG2D识别应激配体）被激活；NK细胞活化需要直接接触或高浓度可溶性应激配体，而封装大幅降低了这两种可能性。体内实验聚焦于胶囊生物相容性、局部组织反应和结构稳定性，而非封装细胞的免疫识别，样本量较小（每组每时间点n=3）限制了统计效能。研究未评估移植细胞命运、分化状态、内分泌功能或潜在不良变化，也未在糖尿病模型中评估功能性移植物疗效。进一步优化生物材料性质和基因工程策略（如CIITA敲除或CD47过表达），以及在人源化模型和胶囊完整性受损条件下的研究，将有助于确定上述策略组合是否提供额外体内保护。研究结论为：尽管封装与B2M基因敲除的组合显著降低了体外免疫细胞相互作用并减轻了体内异物反应，但残余T细胞活化表明当前技术仍提供不完全的免疫保护。然而，本研究所采用的多层策略为开发免疫保护的糖尿病细胞替代疗法提供了合理框架。