《Cells》：FAM65B Regulates Proliferation, Cell Junctions, and Cytoskeletal Organization in Chicken Sertoli Cells
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公鸡精液品质是家禽重要的繁殖性状，但其遗传调控机制尚不明确。支持细胞（Sertoli cells，SCs）对于建立血睾屏障和支持精子发生至关重要。研究人员前期的单细胞转录组分析发现，FAM65B（Family with sequence similarity
公鸡精液品质是家禽重要的繁殖性状，但其遗传调控机制尚不明确。支持细胞（Sertoli cells，SCs）对于建立血睾屏障和支持精子发生至关重要。研究人员前期的单细胞转录组分析发现，FAM65B（Family with sequence similarity 65，member B）是一个在SCs中特异性富集的基因，并且在精液品质高的公鸡睾丸中显著上调。鉴于其在细胞增殖、黏附和细胞骨架重塑中的已知作用，研究人员结合体外实验和组织学方法，系统研究了FAM65B在鸡睾丸中的时空表达模式及其在SCs生理功能中的作用。结果表明，FAM65B主要定位于SCs细胞质。转录组分析显示，敲低FAM65B下调了参与细胞黏附、细胞因子信号传导以及PI3K-Akt和NF-κB通路的基因。敲低FAM65B显著抑制了SCs增殖，降低了连接相关分子的表达，并损害了细胞骨架重排；而其过表达则促进了增殖，增强了F-肌动蛋白丝状结构，并加强了细胞间接触。总之，研究人员的发现确立了FAM65B作为鸡SCs功能的新型正调控因子。这些细胞水平的发现，连同FAM65B表达与精液品质性状之间的关联，为进一步研究禽类雄性生殖中SCs生物学提供了基础。
研究背景与目的
在家禽生产中，公鸡的精液品质是决定受精率、孵化率和雏鸡质量的首要因素。精子发生的正常进行依赖于睾丸内支持细胞（Sertoli cells，SCs）的功能。SCs是唯一与生殖细胞直接接触的体细胞，不仅提供物理支持和营养，还通过血睾屏障（blood–testis barrier，BTB）创造独特的免疫豁免微环境，并通过分泌生长因子调控精原干细胞命运。然而，家禽特别是鸡的SCs功能的分子调控机制在很大程度上仍是未知的，这阻碍了解决公鸡繁殖效率低下问题的靶向策略开发。
研究人员的初步单细胞RNA测序（scRNA-seq）发现，FAM65B（Family with sequence similarity 65，member B）是一个在SCs中特异性高表达的基因，且在精液品质优良的公鸡中表达更高。FAM65B是小GTP酶RhoA的非典型抑制剂，也是FOXO1的转录靶点，参与细胞周期调控、中性粒细胞黏附和极化以及成肌细胞迁移融合等依赖细胞骨架的过程。鉴于RhoA信号与PI3K-Akt通路和NF-κB通路均存在交互作用，而这两条通路分别调控细胞增殖存活和多种细胞反应，研究人员假设FAM65B是调控SCs增殖和细胞连接的关键因子，从而影响公鸡的精子发生和精液品质。
主要研究方法
本研究使用了来自海南（潭牛）文昌鸡有限公司的35周龄文昌公鸡，根据精液量、精子浓度和总活力综合评分选取高、低精液品质组（每组n=4）。从18日龄鸡胚（湖北峪口禽业有限公司，荆州）分离原代性腺支持细胞（SCs）。采用小干扰RNA（siRNA）敲低和pcDNA3.1（+）载体过表达进行功能获得与缺失实验。通过Illumina HiSeq X-Ten平台进行RNA测序（RNA-seq），利用clusterProfiler包进行GO和KEGG富集分析。使用免疫组织化学（IHC）、免疫荧光（IF）、Western blotting（WB）和定量实时PCR（qPCR）检测基因和蛋白表达。EdU掺入实验评估细胞增殖，罗丹明标记鬼笔环肽染色观察F-肌动蛋白（F-actin）。
研究结果
3.1 FAM65B在公鸡睾丸中的时空表达与细胞定位
qPCR结果显示，FAM65B在36周龄公鸡多个组织中广泛表达，甲状腺中最高，睾丸中中等水平。在睾丸中，其表达呈现双峰：第一个高峰在3周龄，对应SCs快速增殖期；第二个高峰在12-20周龄，对应性成熟启动期。qPCR和IHC均证实，高精液品质（CH）组睾丸中FAM65B表达显著高于低精液品质（CL）组。IHC显示FAM65B蛋白在生精上皮呈束状分布。双重IF染色表明，FAM65B与SCs标志物SOX9共定位，且定位于SCs细胞质中。
3.2 FAM65B敲低后SCs的转录组分析
对转染si-FAM65B或si-NC的SCs进行RNA-seq，鉴定出1820个上调基因和938个下调基因。GO和KEGG富集分析显示，上调基因富集于核糖体结构、翻译和氧化磷酸化；下调基因显著富集于细胞黏附、趋化性、细胞因子-细胞因子受体相互作用、NF-κB和PI3K-Akt信号通路。GSEA进一步确认了趋化因子活性、成纤维细胞生长因子受体结合、同嗜性细胞黏附、NF-κB和JAK-STAT信号通路基因集的显著下调。
3.3 FAM65B调控支持细胞增殖
敲低FAM65B后，qPCR和WB显示增殖标志基因PCNA的mRNA和蛋白水平显著下降，EdU掺入实验显示增殖细胞比例显著降低。相反，过表达FAM65B导致PCNA表达显著升高，EdU阳性细胞比例显著增加。结果表明FAM65B正向调控鸡SCs增殖。
3.4 FAM65B调节SCs细胞连接完整性和细胞骨架组织
敲低FAM65B后，qPCR显示ZO-1、JAM-A、β-catenin和GJA1的mRNA水平显著降低，N-cadherin无显著变化；WB证实ZO-1和β-catenin蛋白水平显著下降。鬼笔环肽染色显示，敲低组SCs细胞骨架紊乱，应力纤维不规则、断裂，细胞间接触松散。过表达FAM65B则显著上调连接相关基因（ZO-1、JAM-A、N-cadherin、β-catenin、GJA1）的mRNA水平，增加ZO-1和β-catenin蛋白水平，并使F-actin网络更加强健有序，形成突出的丝状结构和紧凑的细胞间接触。
讨论与结论
讨论部分指出，本研究首次提供了FAM65B是禽类精子发生关键调控因子的功能证据。FAM65B在睾丸发育中的双相表达模式与其双重作用一致：早期参与扩增SCs群体，后期维持SCs功能以支持生殖细胞发育。RNA-seq揭示的PI3K-Akt和NF-κB通路下调为SCs增殖抑制提供了分子解释。FAM65B对连接蛋白和细胞骨架的调控可能通过调节RhoA活性实现，从而协调BTB的动态重塑和SCs极性维持。研究也指出了局限性，如未直接评估屏障功能、未检测β-catenin磷酸化状态、实验使用胚胎SCs而非成年公鸡体内模型等。
结论：本研究表明，FAM65B是鸡支持细胞功能的一个新型且关键的调控因子。FAM65B正向调控支持细胞增殖、连接相关分子的表达以及细胞骨架的组织。这些发现填补了禽类支持细胞生物学认知的重要空白，并结合FAM65B表达与精液品质性状的正相关性，为进一步探究其在公鸡繁殖性能中的潜在作用奠定了基础。
