TLR7缺失揭示重症甲型流感病毒感染中呼吸系统与全身免疫应答的区室特异性重塑

《Cells》：TLR7 Deficiency Reveals Compartment-Specific Respiratory–Systemic Immune Responses During Severe Influenza A Virus Infection

　　

甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）感染可由局部呼吸道疾病进展为以肺部炎症、全身性细胞因子血症、急性期反应和多器官病理为特征的严重疾病。Toll样受体7（Toll-like receptor 7，TLR7）是病毒单链RNA（single-stranded RNA，ssRNA）的关键传感器，也是抗病毒免疫的重要组成部分；然而，在重症IAV感染期间，TLR7将免疫应答从呼吸道扩展至外周区室的作用仍未完全明确。在此，研究人员调查了IAV感染期间TLR7与呼吸及外周区室中固有免疫、细胞免疫和体液免疫应答之间的关系。研究人员使用感染高致病性PR8 H1N1株的TLR7缺陷小鼠，分析了鼻组织、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）、肺、血和脾中的免疫应答，并结合细胞因子产生、C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）水平、T细胞活化和抗体同种型应答。TLR7缺失伴随固有免疫的区室特异性改变，包括肺巨噬细胞和树突状细胞（dendritic cell，DC）应答差异，以及浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cell，pDC）在呼吸和外周区室中的分布改变。研究人员还观察到病毒特异性CD8⁺ T细胞扩增减少、T细胞产生干扰素-γ（interferon-γ，IFNγ）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNFα）降低，以及循环炎症细胞因子和CRP减少。同时，体液应答改变包括黏膜免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）、全身免疫球蛋白M（IgM）和辅助性T细胞1（T helper 1，Th1）相关免疫球蛋白G2a（IgG2a）应答降低，并伴抗体同种型分布变化。总体而言，这些发现表明，在已建立的IAV感染期间，TLR7缺陷与固有免疫和适应性免疫应答的广泛区室特异性改变相关，这些改变跨越呼吸道、血和脾，并与疾病严重程度相关。这些发现支持TLR7相关信号在塑造更广泛的呼吸系统-全身免疫应答中的作用，其存在与抗病毒免疫参与及重症IAV感染期间全身炎症程度相关。

论文解读：该研究围绕重症甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）感染中呼吸系统与全身免疫应答的空间组织问题展开。IAV每年可感染多达十亿人，重症可超出肺部，表现为肺部炎症、循环细胞因子、急性期反应、血管功能障碍及多器官受累。炎症介质如干扰素-γ（interferon-γ，IFNγ）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）和白细胞介素与呼吸衰竭、多器官功能障碍及死亡相关；C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）升高反映全身炎症并可能导致组织损伤。肺部炎症并不总与同等程度的全身炎症相关，提示存在控制免疫应答空间协调和播散的机制。Toll样受体7（Toll-like receptor 7，TLR7）是IAV来源单链RNA（single-stranded RNA，ssRNA）的关键传感器，可驱动抗病毒、促炎、固有和体液免疫；但过度或持续TLR7激活也可加重病毒诱导的肺部炎症和呼吸功能损害，且TLR7直接刺激可驱动全身免疫激活，失调TLR7信号与全身炎症和自身免疫病相关。因此，TLR7可能是连接局部呼吸道病毒感知与更广泛全身免疫激活的分子环节，但其在重症IAV感染中如何影响从病毒检测、抗原处理到固有招募、适应性激活和全身炎症病理的级联仍不清楚。研究人员因此采用TLR7缺陷小鼠感染高致病性PR8 H1N1株，跨鼻组织、肺、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）、血和脾进行综合免疫分析，并评估循环细胞因子、病毒特异性T细胞和抗体应答，以判断TLR7缺失是否与已建立重症IAV感染期间免疫应答的空间组织和幅度相关。研究得出，TLR7缺失伴随从呼吸道延伸至全身的区室特异性改变，支持TLR7相关信号在塑造更广泛呼吸系统-全身免疫应答中的作用，其存在与抗病毒免疫参与及全身炎症程度相关；这些发现为研究TLR7状态、病毒载量和补偿性免疫感知通路如何参与抗病毒免疫和炎症提供了基础，包括TLR7调节能否改变炎症反应而保留有效抗病毒防御。

关键技术方法：研究采用C57BL/6J野生型（wild-type，WT；RRID:IMSR_JAX:000664）和TLR7缺陷（TLR7 knockout，TLR7 KO；B6.129S1-Tlr7^tm1Flv/J；RRID:IMSR_JAX:008380）雄性小鼠（14–18周龄），TLR7缺陷小鼠源自The Jackson Laboratory并在RMIT University动物研究设施维持；以50 PFU的A/Puerto Rico/8/1934 H1N1（PR8）滴鼻感染，设PBS对照，7或14 dpi采集鼻组织、BALF、肺、血和脾。采用流式细胞术分析固有免疫细胞、T细胞亚群、胞内IFNγ/TNFα、活化标志和病毒特异性CD8⁺ T细胞；采用多重免疫分析检测血浆细胞因子/趋化因子及BALF/血浆抗体同种型；ELISA检测CRP；RT-qPCR检测病毒M基因和炎症基因；采用双因素方差分析（ANOVA）及Tukey事后检验。

研究结果如下。3.1 固有免疫细胞频率在WT与TLR7缺陷小鼠的呼吸和全身组织中存在差异：研究人员通过流式细胞术在感染后7天检测鼻组织、BALF、肺、血和脾中的固有免疫细胞，发现WT小鼠感染后Ly6C⁺单核细胞在鼻组织和循环减少、在BALF和肺增加，F4/80⁺巨噬细胞在鼻组织、BALF和血减少、在肺和脾增加，Ly6G⁺中性粒细胞在BALF和肺增加、循环减少，自然杀伤（natural killer，NK）细胞在呼吸组织增加，MHC-II⁺经典DC和PDCA-1⁺ pDC在BALF、肺和脾增加。TLR7 KO小鼠感染后BALF单核细胞增加但肺内增加缺失，肺和脾巨噬细胞积聚缺失或减少，BALF中性粒细胞增加但肺内增加不明显而鼻组织中性粒细胞增加，NK细胞未见显著增加，经典DC在BALF、肺、血和脾增加但呼吸区室低于WT；pDC在WT的BALF、肺和脾增加，在TLR7 KO中该反应显著减弱，而TLR7 KO鼻组织pDC增加且WT无相应增加，循环pDC无显著差异。结论是TLR7缺失并非普遍降低固有免疫，而是呈现细胞群和区室特异差异，肺内巨噬细胞、中性粒细胞和经典DC差异明显，pDC在鼻组织与下呼吸道/脾呈相反模式。

3.2 TLR7缺失时区室特异性适应性免疫及全身细胞毒性T细胞扩增存在差异：研究人员通过流式细胞术分析适应性免疫细胞，发现WT小鼠感染后鼻组织和肺CD4⁺ T细胞增加，所有检测组织CD8⁺ T细胞增加，肺和脾调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）增加，鼻组织、BALF、血和脾B细胞增加。TLR7 KO小鼠感染后血CD4⁺ T细胞增加但鼻组织和肺未增加，呼吸和全身组织中CD8⁺ T细胞未见显著增加，肺和脾Treg增加而B细胞仅脾增加。WT与TLR7 KO比较显示，WT的CD8⁺ T细胞在鼻组织、BALF、肺、血和脾均高于TLR7 KO；WT鼻组织、BALF和血B细胞高于TLR7 KO；TLR7 KO BALF中CD4⁺辅助T细胞和Treg增加而WT无。结论是CD8⁺ T细胞频率在基因型间跨呼吸和全身组织表现最一致差异，其他适应性细胞群模式较局限。

3.3 TLR7功能正常小鼠IAV感染与全身细胞因子血症和T细胞活化相关：研究人员通过血浆多重检测、胞内细胞因子染色、活化标志和病毒特异性四聚体分析，发现WT小鼠感染后鼻和肺组织IFNB、IFNG和TNFA表达诱导，TLR7 KO肺内病毒转录本显著减少而鼻组织相似；WT血浆IFNγ、TNFα、CXCL2、CCL2和CXCL10显著增加，TLR7 KO中除CXCL10外均显著减弱。WT感染小鼠CD4⁺和CD8⁺ T细胞产生IFNγ和TNFα增加，TLR7 KO显著降低；NK细胞也产生IFNγ但该时点不受TLR7缺失影响。WT肺、血和脾CD44⁺CD69⁺T细胞频率增加且TLR7 KO较低，病毒特异性PA224⁺CD8⁺ T细胞在WT呼吸和全身区室更丰富。结论是TLR7存在与全身IFNγ/TNFα反应及抗原经历和病毒特异性T细胞反应幅度相关。

3.4 CRP水平与临床疾病严重程度相关：研究人员通过临床严重度评分、BALF和血浆CRP的ELISA及Pearson相关分析，发现WT小鼠PR8感染后临床严重度评分高于TLR7 KO，BALF和血浆CRP在WT感染后升高而TLR7 KO较低，血浆CRP水平与所分析动物的临床严重度呈正相关。结论是CRP浓度差异与临床严重度差异同时出现。

3.5 WT与TLR7 KO小鼠黏膜和全身抗体同种型谱存在差异：研究人员在14 dpi通过多重免疫分析检测BALF和血浆抗体同种型，发现WT BALF中IgA、IgE、IgM和IgG亚类增加；TLR7 KO也可检测到抗体，但IgA和IgG2a显著低于WT。血浆中两种基因型感染后多种抗体同种型广泛增加，但TLR7 KO血浆IgG2a和IgM低于WT而IgG3高于WT，IgG2a/IgG1比值较低，提示Th1极化体液反应改变。结论是TLR7缺失与黏膜和全身抗体同种型浓度差异相关，并非简单总体抗体产生减少，而是体液应答组成改变。

讨论部分总结：作者指出，TLR7缺失相关的免疫差异可能部分反映病毒控制差异；PR8滴鼻感染肺病毒载量通常在约3至6 dpi达峰，而本研究主要免疫表型分析在7 dpi进行，此时肺病毒转录本在TLR7 KO降低而鼻组织相似，因此较低的全身细胞因子和适应性反应可能部分反映肺病毒或抗原负荷及炎症刺激差异，但本研究不能确定其程度。其他可能因素包括全球KO模型的基线生理、发育或行为差异，以及TLR3和RIG-I等其他模式识别受体的补偿或冗余病毒感知；研究未设计区分这些可能，直接和间接后果的相对贡献仍未解决。作者认为，肺巨噬细胞和DC反应、脾pDC/巨噬细胞反应、病毒特异性CD8⁺ T细胞扩增和全身细胞因子血症的选择性受损，符合TLR7在IAV感染中更广泛作用及免疫反应区室组织；pDC在鼻区室与下呼吸道和脾的相反模式提示pDC分布改变，而pDC促进I型IFN产生和T细胞 priming，肺和脾pDC减少可能对应观察到的适应性反应减弱。CD8⁺ T细胞反应在呼吸和全身区室表现最一致差异，并伴T细胞胞内IFNγ产生减少；NK细胞也产生IFNγ但该时点基因型间无显著差异，而TLR7 KO呼吸组织NK积聚减少，提示NK差异可能持续至感染后期。作者强调细胞毒性反应具有保护与致病双重意义，WT中较强T细胞活化伴随较高循环IFNγ、TNFα、CXCL2、CCL2及BALF和血浆CRP升高，而TLR7 KO中这些感染诱导的全身反应显著受抑。血浆CRP与临床严重度正相关，支持第7天全身免疫表型与疾病严重度相关；CRP是全身炎症和组织损伤的临床标志，其与全身细胞因子和活化CD8⁺ T细胞同时升高，符合重症流感与全身炎症、血管功能障碍和多器官受累相关。TLR7缺失还与黏膜和全身抗体水平改变相关：BALF IgA降低提示黏膜抗体产生缺陷，血浆IgM降低提示早期全身体液激活受损，IgG2a及IgG2a/IgG1比值降低符合Th1相关类别转换受损，IgG3升高说明TLR7缺失并非简单减少抗体产生而是改变体液反应组成；这些差异不能确定是否反映B细胞发育、活化、抗体产生的直接变化或其他间接后果，但支持TLR7参与B细胞成熟、抗体类别转换和Th1偏倚体液免疫。作者还指出TLR7识别其他ssRNA呼吸道病毒RNA，TLR7依赖的早期I型IFN反应在实验性SARS-CoV-2感染中具保护作用，而TLR7信号受损和I型IFN反应缺陷与重症COVID-19相关；TLR7效应取决于激活时机、幅度及病毒和组织背景，感染前刺激TLR7可启动抗病毒状态并限制IAV诱导的疾病，而感染建立后用药理抑制可减少细胞因子产生和肺部免疫病理，提示TLR7作为治疗靶点需区分早期抗病毒功能与后期炎症效应，并注意降低TLR7表达可能存在的权衡：减轻全身炎症可能限制急性炎症病理，但DC和T细胞反应受损可能影响持久抗病毒免疫。

研究结论翻译：本研究证明，TLR7缺陷与已建立IAV感染期间固有免疫和适应性免疫应答的空间分布及幅度显著改变相关。这些差异跨越上、下呼吸道、血和脾，包括髓系和DC反应改变、全身细胞毒性T细胞活化降低、循环炎症细胞因子减少、CRP水平降低和体液免疫紊乱。所检测免疫参数范围广而各队列规模相对较小，限制了统计效能并增加了一些观察差异和相关性周围的不确定性；因此这些发现应谨慎解释。这些发现的区室特异性凸显了TLR7状态与重症IAV感染期间更广泛呼吸系统-全身免疫应答之间的关联。然而，由于本研究采用全球TLR7缺陷模型，观察到的差异不能完全归因于TLR7信号的直接效应，病毒载量改变、补偿性免疫感知通路及TLR7缺陷其他后果的潜在贡献仍有待确定。因此需要进一步研究以阐明这些差异的机制。尽管本研究未评估治疗性靶向，这些发现为未来研究提供了基础，以检验感染期间TLR7调节是否以及如何改变炎症反应而保留有效抗病毒免疫。此类研究应评估多个组织区室，以捕捉对呼吸和全身免疫应答的潜在影响。