《Cells》：iPSC-Derived T and CAR-T Cells of Distinct Phenotypes: Current Protocols, Challenges and Potential for Cancer Treatment
过继性T细胞疗法已在若干血液系统恶性肿瘤中显示出显著的临床疗效，但自体细胞的生产过程仍受限于起始细胞材料的变异性、生产时间、产物异质性以及T细胞功能障碍。诱导多能干细胞（iPSCs）为生成标准化同种异体T细胞产品提供了潜在的可规模化且可进行基因工程的细胞来源。本综述总结了将iPSCs分化为不同表型T细胞的现行策略，并评估其在肿瘤免疫治疗中的潜力。研究人员首先讨论了iPSC来源的传统αβ T细胞，包括无饲养层、可规模化分化、成熟及基因工程方面的最新进展，以及临床前和早期临床证据。随后，研究人员重点分析了γδ T细胞、恒定自然杀伤T细胞（iNKT）和黏膜相关恒定T细胞（MAIT），聚焦其独特的抗原识别机制、效应功能、组织嗜性、分化策略及治疗应用。在上述细胞群体中，iPSC技术有望实现标准化、规模化生产，同时能够对T细胞的特异性和功能特性进行精准工程化改造。然而，仍存在重要挑战，包括高效的谱系特异性分化、细胞成熟、表型一致性、长期体内持久性、肿瘤浸润能力，以及同种异体反应性和免疫原性的控制。总体而言，iPSC来源的T细胞代表了开发多样化细胞免疫疗法的通用平台，但其临床潜力仍有赖于进一步的技术与转化医学进展。
**1. 引言**
恶性肿瘤是导致全球死亡的主要原因之一。肿瘤的发生一方面源于细胞获得无限增殖、逃避凋亡及正常分化的能力；另一方面与机体对肿瘤细胞的免疫监控逐渐丧失有关。肿瘤进化出多种逃避免疫监视的机制，包括肿瘤相关抗原丢失、分泌免疫抑制分子（如TGF-β、ARG1、IL-10、IDO1和IL-35）以及建立免疫抑制性肿瘤微环境。肿瘤微环境中积累的髓源性抑制细胞、调节性T细胞（TREGs）、Th17细胞、肿瘤相关巨噬细胞及癌症相关成纤维细胞可损害CTL和NK细胞的效应功能。细胞免疫治疗基于向患者输注活体免疫细胞以靶向和清除肿瘤细胞。过继性细胞治疗（ACT）是其中主要的发展方向。嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法是目前开发最为成熟的方法。截至2026年9月，已有7种CAR T细胞产品获批用于B细胞恶性肿瘤的治疗。所有已获批产品均基于自体细胞，存在适用患者群体较窄、主要局限于血液肿瘤等局限。因此，基于iPSCs的同种异体产品具有广阔前景。T细胞表型多样性使得可根据特定治疗目标选择最适宜的细胞群体，包括CD4
+/CD8
+ αβ T细胞、γδ T细胞、iNKT细胞和MAIT细胞。
**2. 自体CAR T疗法的成功与局限**
抗CD19和抗BCMA CAR T细胞的临床疗效已被反复证实，但部分患者因严重禁忌证而无法接受治疗，包括HIV感染者、T细胞淋巴瘤患者或既往接受过CAR T细胞治疗者。生产失败可由多种因素导致，包括单采细胞活力低、体外扩增能力差、最终细胞剂量低及干扰素-γ产生不足。研究显示，生产失败与单采产物中血小板计数较低、CD4/CD8比值较低及血清乳酸脱氢酶水平较高显著相关。苯达莫司汀治疗可减少CD4
+ T细胞数量、促进T细胞耗竭并损害其增殖能力。所有已批准的自体CAR T产品均基于αβ T淋巴细胞。在CAR T生产初期可选用泛T细胞标志物CD3进行细胞分选，所得混合群体中CD4
+和CD8
+细胞比例因人而异，导致产品变异性。有研究显示较高的CD4比例与较好的治疗效果相关。另一种策略是分别分离CD8
+细胞毒性T淋巴细胞和CD4
+辅助T细胞，分别进行体外扩增和处理，可显著降低产物变异性。CAR T治疗并非对所有病例有效，复发频繁发生。复发可由肿瘤细胞内在机制驱动，也可能与患者相关因素有关。患者T细胞区室组成改变，表现为初始T细胞比例降低、分化程度更高的T细胞群体（效应和效应记忆细胞）积累。2014年的一项研究在14例接受抗CD19 CAR T细胞治疗的淋巴瘤患者中评估了不同细胞亚群对体内扩增和持久性的贡献，发现CD8
+CD45RA
+CCR7
+表型（T
SCM样）细胞对体内持久性贡献最大。Sommermeyer等人的研究表明，由初始T细胞（T
N）来源的CAR T细胞抗肿瘤活性最高，其次是中央记忆T细胞（T
CM）；最有效的组合为CD4
+ T
N细胞与CD8
+ T
CM细胞，以及CD4
+ T
CM细胞与CD8
+ T
CM细胞。延长体外扩增与CCR7
+记忆细胞比例下降、效应分化增加和治疗性能下降相关。自体CAR T疗法的其他限制包括产品标准化不足、细胞剂量差异大以及细胞因子释放综合征（CRS）、免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）、肿瘤溶解综合征和脱靶毒性等不良事件。
**3. 同种异体CAR T疗法**
同种异体CAR T细胞疗法有望克服上述局限。潜在的同种异体细胞来源包括供者来源T细胞、脐带血造血干细胞（HSCs）和iPSCs。大部分研究仍处于I期阶段，主要评估产品安全性。血液系统恶性肿瘤仍是最广泛研究的疾病类别。同种异体CAR T细胞开发的关键特征是需要引入额外的基因修饰，以防止移植物抗宿主病（GvHD）并逃避受者免疫系统的监视。
**3.1. iPSC来源的同种异体T细胞疗法**
iPSC来源的T细胞有望克服自体T细胞疗法的诸多局限。iPSC可以接受广泛的基因工程改造，并可作为T细胞的可再生来源。与患者来源的功能耗竭T细胞不同，iPSC可提供分化程度较低、未经历长期抗原刺激所致耗竭的细胞群体。2006年，Yamanaka和Takahashi首次描述了iPSC的生成，鉴定出四种关键转录因子（Oct3/4、Klf4、Sox2和c-Myc）。2009年，iPSC被证明可向T细胞谱系分化。2013年，Nishimura等人首次描述了从具有确定抗原特异性的成熟CD8
+ T细胞生成iPSC并再分化为功能活跃的细胞毒性T细胞，证明了产生" rejuvenated"（ rejuvenated）T细胞的潜力。这些细胞保留了对特定抗原的T细胞受体，具有高增殖活性，同时保留细胞毒性、干扰素-γ产生和脱颗粒等效应功能。此后大量研究集中于开发不同的T细胞生成方案以及将iPSC技术与肿瘤相关抗原靶向策略相结合。
**3.2. 肿瘤免疫治疗中的αβ T细胞**
αβ T细胞是CAR T细胞疗法中验证最充分的T淋巴细胞群体。已批准的CAR T产品主要基于该细胞类型。iPSC向αβ T细胞分化后结合额外的基因修饰，有望生成更通用的、现货型治疗产品。
**3.2.1. iPSC向αβ T细胞的分化：局限与挑战**
经典方案涉及将iPSC与表达Notch配体DLL1或DLL4的鼠基质细胞共培养。饲养层依赖方案的局限在于其临床转化适用性有限。常规二维分化方案常产生不完全成熟的CD5
-/low T细胞和CD5
+CD7
+祖细胞群体，需要额外成熟步骤。部分二维分化方案中细胞易获得类固有免疫表型，包括出现类似NK细胞或γδ T细胞的群体。2021年Iriguchi等人开发了无血清、无饲养层系统以实现CD8αβ T细胞分化，使用CHIR99021、BMP-4、bFGF和VEGF诱导向中胚层和造血祖细胞分化，在重组人DL-4包被的培养板上进行T细胞分化，并添加SCF、TPO、FLT3L和IL-7。CXCL12与p38抑制剂SB203580的联合使用可协同增加DP细胞和未成熟CD8
+细胞产量。通过抗CD3抗体刺激诱导成熟为CD8
+ T细胞，在IL-7、IL-15、IL-21、IL-12、IL-18及TL1A联合作用下实现了约400倍扩增，总扩增倍数达5166倍。该平台与CAR工程兼容。由于所得细胞保留内源TCR，仍存在GvHD风险，需要额外的基因修饰。其他无饲养层系统包括DLL4与VCAM1联合包被的培养表面，以及DLL4包被的微珠。iCD4SP T细胞的成熟仍是更具挑战性的任务，2024年提出了使用PMA和离子霉素刺激产生iCD4
+ Tregs的无饲养层方法。2026年Amirault等人证明在iPSC体系中，已定型DP祖细胞向CD4SP T细胞成熟过程中Notch信号变得非必需。
**3.2.2. iαβ T细胞的临床前与临床研究**
在临床前体内模型中，iT和iCAR T细胞对实体瘤和血液肿瘤的疗效已被多次验证。Saito等人的研究证明抗原特异性iCD8
+ T细胞在同基因黑色素瘤模型中可诱导已建立的肿瘤消退，幸存动物产生抗原特异性免疫记忆。CD19-CAR T-iPSC细胞在异种移植模型中有效抑制CD19
+淋巴瘤生长。具有B2M、CIITA和PVR敲除及HLA-E工程化表达的CD20 CAR T细胞保留抗肿瘤活性并增强了对同种异体免疫应答的抵抗性。敲除DGKα和DGKζ基因并引入膜结合型IL-15/IL-15Rα基因可增强iCD8αβ细胞毒性CAR T细胞在肿瘤内的增殖和持久性。首次CD19 iCAR T细胞临床给药已在复发/难治性B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病和B细胞急性淋巴细胞白血病患者中完成。iPSC来源T细胞的临床转化需要减少同种异体反应性和免疫原性的额外修饰。常用策略包括破坏内源TCR以降低GvHD风险，破坏B2M基因导致HLA I类缺失以防止宿主介导的排斥反应。为克服HLA I类缺失引起的NK细胞"missing-self"应答，可采用HLA-E、HLA-G1过表达及CD47过表达等策略。CIITA基因破坏导致MHC II类基因表达缺失。
**3.3. 肿瘤免疫治疗中的γδ T细胞**
γδ T淋巴细胞是独特的异质性T细胞群体，其TCR由γ和δ链组成，是胚胎胸腺中最早发育的T细胞群体之一。多数外周血γδ T淋巴细胞缺乏CD4和CD8辅助受体，相当比例的细胞以MHC非限制方式识别抗原。γδ T细胞可表达NKG2D、NKG2/CD94和Toll样受体（TLRs），兼具有T细胞和NK细胞相关的表型和功能特征。其广泛的组织分布使其成为治疗实体瘤的候选效应细胞。γδ T细胞通过TCR介导的激活（适应性免疫特征）与NK相关受体激活（固有免疫特征）相结合，还可通过CD16介导抗体依赖性细胞毒性（ADCC）。根据Vδ链可分为Vδ1、Vδ2和Vδ3三个主要群体。Vγ9Vδ2细胞可识别磷酸抗原（如HMBPP和IPP）。部分γδ T细胞群体可发挥免疫调节功能，而其他群体可介导细胞毒性，因此γδ T细胞可能具有促肿瘤或抗肿瘤效应。在实体瘤中，Vδ1
+细胞是最常出现的γδ T细胞亚群，可获促肿瘤表型，产生IL-4、IL-17、IL-10和TGF-β等细胞因子。抗肿瘤表型的γδ T细胞更常见于Vδ2
+亚群，产生穿孔素、颗粒酶及IFN-γ和TNF-α。外周血中γδ T细胞仅约占淋巴细胞总数的5%，在肿瘤患者中可能减少并获耗竭表型，其体外扩增面临挑战，因此iPSC来源γδ T细胞成为重要研究方向。
**3.3.1. iPSC向γδ T细胞的分化：局限与挑战**
使用γδ T细胞作为起始材料的主要优势在于其基因组已含有经V(D)J重组产生的重排γ链和δ链TCR基因座，重编程后保留既有TCR基因重排，可生成具有预定TCR特异性的T细胞。γδ T细胞在发育过程中可在DN和DP阶段产生。早期分化阶段与αβ T细胞分化方案大体重叠：在Notch配体DLL1及Flt3L、SCF、IL-7等细胞因子存在下将CD34
+/CD43
+造血祖细胞导向T细胞谱系。2023年Murai等人使用OP9-DLL1饲养层系统结合Flt3L、SCF、IL-7、TPO和抗坏血酸进行早期分化，随后转入含2-巯基乙醇、IL-2和HMBPP的无饲养层系统，所得γδ T细胞对多种肿瘤细胞系具有细胞毒性。2019年提出了生成"mimetic"γδ T细胞的策略：在OP9细胞上进行造血分化后转至OP9-DLL1细胞进行淋巴样分化，所得细胞53%为γδTCR
+CD3
+，为Vγ9
+Vδ2
+并产生NK细胞标志物CD56。与常规γδ T细胞相比，这些细胞产生更广泛的激活性NK受体库以及CD16、TRAIL和FasL。无饲养层、无血清分化方案可在VCAM1和DLL4包被的培养板上进行T谱系分化，以HMBPP作为关键γδ T细胞特异性刺激物。所得约70%的细胞表面表达CD3，但功能表型分析显示多数细胞获得了终末效应记忆（T
EMRA）表型，这引发了关于体内长期持久性和增殖潜力的疑问。
**3.3.2. iγδ T细胞的临床前与临床研究**
多项研究表明Vγ9Vδ2 T细胞在滤泡性淋巴瘤、皮肤癌、肾癌、前列腺癌等肿瘤中具有高抗肿瘤潜力。临床试验已证明体外扩增的Vγ9Vδ2 T细胞过继转移的可行性和安全性，但早期临床研究中治疗效果仍有限。截至2026年，已有超过90项使用γδ T细胞的临床试验注册。历史研究多集中于Vγ9Vδ2 T细胞，最近对Vδ1 T细胞的兴趣日益增加。由于未修饰γδ T细胞疗效有限，研究正逐步转向CAR修饰的γδ T细胞。iPSC来源γδ T细胞的已发表数据仍仅限于临床前研究，尚无临床试验报道。2026年首次在患者来源的结直肠癌肿瘤类器官模型中证明了此类细胞的细胞毒性活性。靶向CD19和CD22的双特异性CAR修饰iγδ T细胞的抗肿瘤活性已在体外及体内OCI-Ly1模型中得到证实。
**3.4. 肿瘤免疫治疗中的iNKT细胞**
自然杀伤T细胞（NKT）兼具天然免疫和适应性免疫特征。iNKT细胞携带半恒定TCR，在人类由Vα24-Jα18和Vβ11链组成，识别由CD1d分子呈递的脂质或糖脂抗原（如α-半乳糖基神经酰胺，αGalCer）。iNKT细胞在胸腺中经过激动剂选择发育，存在两个检查点。iNKT细胞可识别CD1d
+肿瘤细胞（通过TCR）和CD1d
-肿瘤细胞（CD1d非依赖但TCR依赖），后者由NK活化受体增强。激活的iNKT细胞产生大量IFNγ，激活NK细胞，促进CD8
+和CD4
+ T细胞活化增殖及树突状细胞成熟，具有重编程肿瘤微环境的能力。外周血中iNKT细胞仅占T细胞的约0.1%，在肿瘤和肥胖患者中数量可能显著减少，因此从iPSC分化获得iNKT细胞具有重要价值。
**3.4.1. iPSC向iNKT细胞的分化**
到DP细胞阶段，iPSC向iNKT和αβ T细胞的分化沿相似路径进行。iNKT细胞在DP阶段需完成编码恒定TCR α链的基因片段（TRAV10–TRAJ18）重排，随后在转录因子PLZF诱导下向iNKT谱系发育。使用成熟原代iNKT细胞来源的iPSC作为起始材料较为简便，起始细胞已携带重排的TCR，且由于表观遗传记忆现象，此类iPSC向i-iNKT细胞的分化潜能更高。2010年Watarai等人首次利用小鼠细胞获得NKT细胞，将iPSC分化为功能性iNKT细胞，可抑制体内肿瘤生长。人i-iNKT细胞的早期研究基于经典饲养层依赖方案，在OP9/DLL1细胞上进行分化并补充SCF、IL-7和FLT3L，主要产生DN iNKT细胞。二维分化方案倾向于产生缺乏CD5表面蛋白的未成熟iNKT细胞。为产生更成熟的iNKT细胞，提出了使用人工胸腺类器官进行iPSC分化的方案，需与产生人Notch配体DLL4的MS5细胞共培养。2025年Kumar等人提出了无饲养层、无血清分化方案，产生表型和功能特征类似原代iNKT细胞的i-iNKT细胞。IL-15对iNKT细胞成熟和功能发育至关重要，缺乏时细胞可能停留在较不分化阶段并表现关键标志物表达不完全。与αβ T细胞不同，i-iNKT细胞不需要复杂的额外成熟程序，可在细胞因子作用下扩增，可能简化下游生产过程。
**3.4.2. i-iNKT细胞的临床前与临床研究**
NKT细胞缺陷小鼠对化学诱导致癌模型中自发性肿瘤更易感。临床前研究证明了未修饰iNKT细胞和CAR工程化iNKT细胞（包括表达抗GD2和抗CD19 CAR的细胞）的抗肿瘤活性。临床前模型也证明iNKT细胞可限制GvHD发展。恶性肿瘤患者的研究显示循环iNKT细胞数量减少与较差的总生存率相关。一项I期临床试验（NCT04754100）证明未修饰iNKT细胞可安全用于同种异体治疗，在复发/难治性多发性骨髓瘤患者中未观察到临床显著GvHD，也未发生严重CRS或ICANS。截至2026年9月，已有9项CAR-NKT临床试验注册，涵盖自体及同种异体策略，针对CD19
+血液肿瘤及GD2
+、CD70
+实体瘤。2025年发表了首个iPSC来源iNKT细胞临床研究结果，10例复发头颈癌患者接受同种异体iPSC来源iNKT细胞动脉内给药，10例中有1例观察到不良事件，2例患者肿瘤进展被抑制，且这些患者CD8
+记忆和效应表型T细胞数量增加。2026年发布了一项新临床试验方案（jRCTa030220741），计划动脉内给药i-iNKT细胞联合鼻黏膜下层注射DC/Gal（经α-半乳糖基神经酰胺处理的树突状细胞）。
**3.5. 肿瘤免疫治疗中的MAIT细胞**
黏膜相关恒定T（MAIT）细胞是具有受限TCR库的类固有αβ T细胞亚群，在肺、肝和肠道固有层中数量较多，外周血中约占循环T细胞的1–10%。人类MAIT细胞表达恒定TCR Vα7.2-Jα33链，与受限的TCR β链库配对。其非经典抗原识别模式以MR1分子为限制，主要呈递核黄素生物合成代谢物。激活后表现出穿孔素和颗粒酶介导的高细胞毒性活性，分泌IFN-γ、TNF-α、GM-CSF和IL-17等细胞因子，表面具有激活性NK受体和TLRs。原代MAIT细胞用于ACT的主要限制是增殖能力相对较低。利用成熟原代MAIT细胞来源的iPSC克隆进行分化时，分化方案与其他T细胞类型基本相似，可获得足够高的细胞产量，但生成具有充分成熟表型的细胞仍是挑战。体内研究表明，iMAIT细胞给药后可在体内成功成熟。小鼠研究表明iPSC来源MAIT细胞过继转移后可主动迁移至多种器官、表现细胞毒性活性、抑制肺转移形成并延长生存期。体外研究证明了从原代细胞生成CAR-MAIT细胞的可能性，CD19-CAR-MAIT、HER2-CAR-MAIT和间皮素-CAR-MAIT细胞均表现出高细胞毒性，但多数研究迄今仅限于体外条件。MAIT细胞结合受限TCR库、主要依赖MR1的抗原识别、低同种异体反应性和显著细胞毒性特性，适合开发同种异体现货型产品。iPSC-MAIT细胞仍是一个有前景但特征尚不充分的平台，其临床潜力有待临床研究证实。
**3.6. iPSC来源T细胞产品的安全与质量控制**
临床转化需要严格的安全和质量评估。主要关注点之一是终产品中残留未分化iPSC或异常分化细胞的可能性，不完整的iPSC分化具有潜在致瘤风险。应将残留多能细胞视为关键杂质，采用流式细胞术检测多能性相关标志物以及定量PCR或数字PCR等分子检测方法。体外致瘤性研究可能视产品风险特征而需要。基因组完整性是另一重要考量。遗传异常可能存在于亲代体细胞中、在重编程过程中产生或在长期iPSC培养和克隆扩增中被富集。基因编辑可能带来脱靶修饰、非预期靶向改变、染色体重排及携带不良遗传改变克隆的选择等额外风险。需要在产品开发的适当阶段进行基因组表征。终产品的特性鉴定、纯度和功能效力需使用产品特异性关键质量属性进行定义。特性鉴定应确认目标T细胞谱系及CAR存在。纯度评估应量化目标群体并识别潜在不良细胞。功能效力评估应包括细胞毒性、细胞因子产生及适当的活化或持久性指标。对于基因工程产品，还应评估CAR功能及额外基因修饰的预期效果。iPSC来源T细胞产品的开发需要预先定义产品特性、纯度、效力、基因组完整性、无菌性及其他安全属性的接受标准，并采用基于风险的放行策略。
**4. 结论**
自体CAR T细胞疗法的疗效已在全球范围内得到证实和确立，同时也明确了与该治疗方法相关的局限和挑战。iPSC技术可能克服与使用自体原代细胞相关的诸多局限。对iPSC及其衍生物进行基因修饰的几乎无限能力，以及制造和扩增体内含量极低的T细胞群体（γδ T、iNKT和MAIT细胞）的能力，使得可精确选择具有最佳体内持久性、扩增能力、肿瘤组织迁移能力以及通过天然和适应性免疫机制介导抗肿瘤活性的细胞表型。不同T细胞亚群具有潜在互补的抗肿瘤活性机制：αβ T细胞具有显著抗原特异性应答机制，而γδ T、iNKT和MAIT细胞则结合了适应性免疫应答特征与固有免疫相关机制。γδ T细胞将通过TCR特异性识别磷酸抗原、脂质分子等抗原与产生多种NKR、TLRs及ADCC受体CD16相结合。iNKT细胞除半恒定TCR和NKRs外，具有激活肿瘤微环境中其他免疫细胞、克服肿瘤细胞免疫抑制效应的独特能力。MAIT细胞具有高器官迁移能力和高细胞毒性活性。非传统T细胞、尤其是iNKT可能更适用于实体瘤治疗。这些互补机制可能为涉及不同T细胞亚群的新型联合iPSC细胞疗法铺平道路。目前的数据表明，尽管若干基于iPSC来源CAR T细胞的技术已进入临床试验阶段，该领域仍需进一步发展，包括细胞功能成熟、表型优化、无饲养层和无血清方案优化以及质量与安全控制方法的确定。iPSC技术最终可能作为CAR T细胞产品工程化平台，允许根据特定治疗目标选择具有确定抗原特异性、表型、效应功能和免疫防御机制的细胞。
