《Foods》：Questions and Challenges Associated with Implementing the Planetary Health Diet: A Narrative Review
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本研究考察了泰国北部清迈地区农场可可发酵过程中微生物群落及其相关理化特性的变化，并在60 kg木箱规模下进行了评估。研究人员对24 h和48 h两种翻堆间隔发酵工艺进行了比较评价。采用基于培养的计数方法和不依赖于培养的分子技术监测微生物种群变化。结果表明，乳酸
本研究考察了泰国北部清迈地区农场可可发酵过程中微生物群落及其相关理化特性的变化，并在60 kg木箱规模下进行了评估。研究人员对24 h和48 h两种翻堆间隔发酵工艺进行了比较评价。采用基于培养的计数方法和不依赖于培养的分子技术监测微生物种群变化。结果表明，乳酸菌（LAB）和醋酸菌（AAB）是整个发酵过程中的优势微生物种群。多变量分析发现，发酵时间显著地将群落从以酵母（Saccharomyces和Hanseniaspora）和细菌（Limosilactobacillus fermentum）为主的群落，转变为以耐酸Acetobacter pasteurianus为主的后期群落。此外，翻堆间隔强烈影响微生物群落，24 h间隔有利于Saccharomyces和Komagataeibacter，而较长的48 h间隔则选择性地促进Candida、Meyerozyma和Acinetobacter的生长。理化性质也显示，两种工艺的总酸度均升高，pH值下降，而还原糖随时间下降。在24 h翻堆工艺（T24）中，还原糖从0 h的64.80 mg/g降至144 h的3.73 mg/g。同样，在48 h翻堆工艺（T48）中，还原糖从0 h的64.29 mg/g降至144 h的3.21 mg/g。果胶酶活性被检测为两种工艺中的主要酶活性。此外，T24工艺显示Saccharomyces、Limosilactobacillus和Lentilactobacillus与关键的果香/甜香酯类呈正相关，而T48工艺中Lentilactobacillus和Acinetobacter与异味相关挥发性标志物（丁酸和二甲基二硫醚）相关。总体而言，更频繁的翻堆明显促进更多与理想香气特征相关的挥发性化合物的产生，标准化翻堆时间表有助于提高批次间香气开发的一致性，并降低放大生产过程中不良风味形成的风险。
研究人员开展了一项关于可可发酵过程中翻堆间隔影响的研究，旨在解析不同翻堆频率对微生物群落动态、理化特性及挥发性风味形成的影响。该研究源于泰国可可种植业的发展需求——当地小农生产者面临劳动力短缺和时间限制，频繁翻堆难以实施，但科学证据缺乏。因此研究人员设计了24 h和48 h两种翻堆间隔的60 kg木箱发酵实验，采用培养依赖与非培养依赖相结合的方法，系统追踪了6天发酵周期内的微生物演替、理化指标变化及风味化合物生成，揭示了翻堆频率作为关键工艺参数在调控发酵质量和风味品质中的核心作用。
研究采用的多学科技术方法包括：基于选择性培养基的微生物计数（培养依赖法）结合16S rRNA基因和ITS区域的高通量扩增子测序（培养非依赖法）分析细菌和真菌群落结构；同时监测温度、pH、总酸度、还原糖等理化参数；利用3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定果胶酶、淀粉酶、羧甲基纤维素酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶活性；通过Heracles NEO电子鼻（GC-E-Nose）结合双柱色谱（MXT-5和MXT-1701）和火焰离子化检测器分析挥发性有机化合物（VOCs），并采用冗余分析（RDA）、典型对应分析（CCA）及Pearson相关性分析解析微生物-环境-风味之间的关联。样本取自泰国清迈当地巧克力生产公司的Chumphon 1品种（Trinidad杂交种的PA7和NA32品系）成熟可可豆荚，在木箱（34×50×40 cm，容量60 kg/处理）中进行同步发酵。
3.1 微生物变化
通过培养计数发现，两种翻堆工艺中活菌总数在24 h后增加，72 h稳定在约6.5 log CFU/g，144 h升至约8.0 log CFU/g。乳酸菌（LAB）在早期（0–48 h）快速达到约9.0 log CFU/g峰值，后期略降至约8.5 log CFU/g；酵母在24–48 h达到约6.5 log CFU/g峰值后逐渐降至约5.0 log CFU/g；产孢细菌在96 h后才出现；大肠菌群在0–72 h存在，96 h后消失。
3.2 真菌种群聚类分析
真菌ITS测序结果显示，24 h翻堆（T24）中Hanseniaspora pseudoguilliermondii主导初期发酵，48 h后转为Saccharomyces cerevisiae为主导，中期出现Meyerozyma、Candida和Cortinarius，后期Fusarium circinatum和Microascus brevicaulis增加。48 h翻堆（T48）则以H. pseudoguilliermondii和Meyerozyma caribbica主导早期，Saccharomyces减少。典型对应分析（CCA）表明发酵时间和翻堆间隔均显著影响真菌群落结构（R2=0.594，p=0.006；R2=0.413，p=0.039），24 h翻堆有利于Saccharomyces维持，48 h翻堆则选择氧化型酵母如Meyerozyma和Candida，后期群落主要由总发酵时间驱动。
3.3 细菌动态
细菌16S rRNA测序显示，T24中Limosilactobacillus fermentum在48 h占优，随后Acetobacter pasteurianus在96–144 h主导（80–90%），并且更频繁翻堆促进Acetobacter和Komagataeibacter的演替。T48中L. fermentum和A. pasteurianus丰度较低，厌氧期延长延迟了Acetobacter发育，增加了Acinetobacter相对丰度。冗余分析（RDA）显示发酵时间（R2=0.532，p=0.006）和翻堆间隔（R2=0.716，p=0.002）均显著关联细菌群落变化，24 h翻堆强烈促进Komagataeibacter，48 h翻堆则选择Acinetobacter、Garicola和Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium复合群。
3.4 理化性质
温度方面，T24从28 °C升至72 h约50 °C，后稳定在45 °C；T48比T24低2–3 °C。总酸度两种工艺均增加，T48在96 h达1.52%（w/w）后降至144 h约1%（w/w），T24在72 h达最大值1%（w/w）后略降至0.75%（w/w）。pH从6降至5，T24略高。还原糖从0 h约64 mg/g降至144 h约3–4 mg/g，T24残留量低于T48。
酶活性方面，T24中果胶酶96 h达峰，甘露聚糖酶72 h达峰，淀粉酶和木聚糖酶24 h达峰后持续下降，羧甲基纤维素酶（CMCase）始终很低。T48中CMCase在48 h最大，果胶酶120 h达峰，甘露聚糖酶48 h最大，淀粉酶24–96 h检出，木聚糖酶整体低且72 h后平稳。果胶酶和甘露聚糖酶在中期（48–72 h）活跃，淀粉酶和木聚糖酶在早期活跃。
挥发性化合物方面，共鉴定46种化合物，包括酯类、酸类、醇类、吡嗪类和含氮化合物、醛酮类、萜烯类和含硫化合物。T24中果香型酯类（乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯）出现于早期，坚果/面包香气化合物出现于后期；醛酮类数量随发酵增加。T48中果香和坚果香在末期才检测到，酸味相关异味化合物在T24处理中较多。更频繁翻堆增加挥发性化合物数量，而过度曝气促进醋酸菌生长产生酸味异味。
3.5 微生物与挥发性化合物相关性
Pearson相关分析显示，T24中Saccharomyces、Limosilactobacillus和Lentilactobacillus与关键果香/甜香酯类（乙酸异戊酯、丁酸乙酯、己酸甲酯、反式-2-丁烯酸乙酯）、多元醇/高级醇（2,3-丁二醇、2-丙醇、S(-)2-甲基-1-丁醇）、萜烯（α-蒎烯）和吡嗪（2,3-二甲基吡嗪）显著正相关；T48中Lentilactobacillus和Acinetobacter与丁酸和二甲基二硫醚显著相关，这些化合物与可可液块中的哈喇味、刺激性异味相关。
讨论与结论部分指出，翻堆间隔通过调控氧气供应、温度积累和微生物代谢活动，显著影响发酵过程中的微生物演替、理化环境及风味前体形成。24 h翻堆促进了Saccharomyces和Komagataeibacter等好氧/微需氧微生物的适宜生长环境，有利于果香酯类合成；48 h翻堆则延长厌氧期，选择氧化型酵母和条件致病菌类群，导致异味相关化合物积累。研究证实果胶酶是主要酶活性，与可可 pulp 降解和风味前体释放密切相关。结论强调，标准化翻堆间隔（尤其是24 h）可提高批次间风味一致性，降低不良风味形成风险，为泰国小农可可产业优化发酵工艺提供了科学依据。然而，由于本研究每个处理仅使用单一发酵箱，且样本为时序重复观测，结果应视为探索性关联，未来需在多个收获季节利用独立发酵箱重复验证，并引入绝对定量和感官评价以确认翻堆间隔对最终巧克力品质的影响。
