《International Journal of Molecular Sciences》：Helicobacter pylori-Derived Outer Membrane Vesicles Promote Hepatocellular Carcinoma Cell Proliferation with PI3K/AKT/mTOR Activation and Cyclin D1 Upregulation
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越来越多的证据提示幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）感染与肝脏疾病之间存在关联；然而，幽门螺杆菌或其胞外产物是否直接影响肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）的生物学行为仍不清楚。本研究检测了活菌幽门螺杆菌、无
越来越多的证据提示幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）感染与肝脏疾病之间存在关联；然而，幽门螺杆菌或其胞外产物是否直接影响肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）的生物学行为仍不清楚。本研究检测了活菌幽门螺杆菌、无菌幽门螺杆菌条件培养基（Hp-CS）以及分离的幽门螺杆菌来源外膜囊泡（Hp-OMVs）对HCC细胞的影响。幽门螺杆菌可黏附并侵入Huh7和Hepa1-6细胞，增加Cyclin D1表达，并促进经细菌暴露的Hepa1-6细胞在免疫功能正常的C57BL/6J小鼠中来源肿瘤的生长。Hp-CS可增强HCC细胞的代谢活性、集落形成、迁移和侵袭能力。通过透射电子显微镜和纳米颗粒跟踪分析对Hp-OMVs进行了表征。暴露于Hp-OMVs可增加HCC细胞的代谢活性、集落形成、细胞周期进程以及同基因小鼠模型中的肿瘤生长。Hp-OMVs还可增加PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平，并升高Cyclin D1表达。PI3K抑制剂LY294002可减弱上述分子变化，并减少Hp-OMV诱导的细胞周期进程和集落形成。上述发现表明，幽门螺杆菌及其胞外产物可在实验性HCC模型中促进增殖相关表型。Hp-OMVs是幽门螺杆菌具有生物学活性的胞外组分，药理学抑制结果支持PI3K/AKT/mTOR信号通路激活和Cyclin D1上调参与其促生长效应。
一、研究背景与科学问题
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是全球第三大癌症相关死亡原因，也是原发性肝癌中最常见的类型。慢性乙型或丙型肝炎病毒感染、酒精性肝病、代谢功能障碍相关脂肪性肝病以及黄曲霉毒素暴露是HCC的主要病因。在既有病因之外，越来越多的证据提示微生物及其来源因子可能影响HCC的发生与进展。
幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）是一种定植于胃黏膜的革兰阴性菌，已被确认为慢性胃炎、消化性溃疡、胃腺癌和胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤的病因。流行病学研究和荟萃分析报道了幽门螺杆菌感染或螺杆菌属检出与HCC之间的关联。分子研究在肝硬化及HCC患者的肝组织中检测到螺杆菌16S rDNA或幽门螺杆菌相关基因片段，但仅有少数研究从病变肝组织中分离到可培养的螺杆菌。因此，活菌幽门螺杆菌能否到达并在人肝脏中持续定植仍存在争议，这提示源自胃部感染部位的细菌产物可能参与所报道的肝脏效应。
外膜囊泡（outer membrane vesicles, OMVs）为这种细菌-宿主通讯提供了潜在机制。OMVs是革兰阴性菌释放的纳米级膜囊泡，能够保护并转运细菌组分至细菌定植部位之外。幽门螺杆菌来源的OMVs（Hp-OMVs）可与宿主细胞相互作用并被内化，为细菌信号递送至胃部微环境之外提供了潜在载体。然而，Hp-OMVs是否直接影响HCC细胞的生物学行为仍不清楚。
PI3K/AKT/mTOR通路在HCC中频繁激活，调控肿瘤生长涉及的多种过程，包括细胞存活、代谢、蛋白质合成和细胞周期进程。Cyclin D1是该通路影响下的细胞周期调控因子，促进G1/S期转换，其在HCC中已有过表达报道。在胃上皮模型中，幽门螺杆菌可激活PI3K/AKT/mTOR信号并促进细胞存活和蛋白质翻译；但幽门螺杆菌能否在HCC细胞中类似地激活该通路并增加Cyclin D1表达尚不明确。基于上述背景，研究人员采用活菌幽门螺杆菌、无菌Hp-CS和分离的Hp-OMVs，在免疫功能正常的同基因小鼠模型中评估其对HCC细胞增殖、细胞周期进程和肿瘤生长的影响，重点关注PI3K/AKT/mTOR信号通路和Cyclin D1表达。
二、主要技术方法
研究人员使用了以下关键技术方法：HCC细胞系Huh7（人源）和Hepa1-6（小鼠源）体外培养体系；幽门螺杆菌SS1菌株（cagA阳性、vacA阳性）的黏附实验和庆大霉素保护实验；透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）和纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis, NTA）用于Hp-OMVs表征；CCK-8细胞代谢活性检测、集落形成实验、Transwell迁移与侵袭实验、划痕愈合实验；流式细胞术进行细胞周期分析；RT-qPCR和Western blot分别检测CCND1 mRNA和Cyclin D1蛋白表达；PI3K抑制剂LY294002进行通路干预；C57BL/6J小鼠皮下同基因肿瘤模型及瘤内注射模型；免疫组织化学染色检测Ki-67和PCNA。
三、研究结果
3.1 活菌幽门螺杆菌与HCC细胞相互作用，短暂暴露增强后续体内肿瘤生长
黏附实验显示，经过充分洗涤后，可从Huh7和Hepa1-6细胞中回收活菌幽门螺杆菌。庆大霉素保护实验进一步在两种细胞系中检测到胞内活菌，表明幽门螺杆菌能够侵入HCC细胞。透射电子显微镜观察到幽门螺杆菌与HCC细胞表面紧密关联。将幽门螺杆菌暴露24小时并充分洗涤后的Hepa1-6细胞皮下植入免疫功能正常的C57BL/6J小鼠后，来源肿瘤的生长较对照组更快，个体小鼠肿瘤体积AUC更高，终点肿瘤重量更大。组织学分析显示，幽门螺杆菌暴露组肿瘤中Ki-67和PCNA阳性区域增加，表明体内增殖活性增强。
3.2 无菌幽门螺杆菌条件培养基促进HCC细胞增殖
将幽门螺杆菌培养上清经离心和0.22 μm滤膜过滤获得无菌Hp-CS。CCK-8检测显示Hp-CS以剂量依赖方式提高两种HCC细胞系的代谢活性，时间进程分析显示相对于处理后的BHI对照，CCK-8信号逐渐增强。集落形成实验显示Hp-CS暴露后两种细胞系的克隆生长能力增加。Transwell实验显示Hp-CS暴露后两种细胞系的迁移和侵袭能力增强，Huh7细胞划痕愈合加速。这表明无菌Hp-CS在无活菌条件下足以促进HCC细胞的增殖、迁移和侵袭相关表型。
3.3 分离的Hp-OMVs在体外和体内重现Hp-CS的关键增殖相关效应
透射电子显微镜显示Hp-OMVs为球形膜结合囊泡，NTA确认其纳米级粒径分布，最终制备物中无可培养活菌。Hp-OMV暴露增加Huh7和Hepa1-6细胞的代谢活性并增强集落形成。流式细胞术分析显示Hp-OMV暴露后出现G0/G1向S期转变。在荷瘤小鼠中，瘤内给予Hp-CS或Hp-OMVs均较对照增强肿瘤生长，二者之间无显著差异。因此，分离的Hp-OMVs重现了Hp-CS的关键增殖相关效应，包括增强HCC细胞生长和体内肿瘤生长，并额外促进G1/S期进程。
3.4 活菌幽门螺杆菌、Hp-CS和Hp-OMVs均增加HCC细胞中CCND1/Cyclin D1表达
RT-qPCR显示Hp-CS和Hp-OMVs均较处理后的BHI对照增加两种HCC细胞系中CCND1 mRNA表达。Western blot证实两种处理条件下Cyclin D1蛋白表达增加。活菌幽门螺杆菌SS1暴露同样增加两种细胞系中CCND1 mRNA和Cyclin D1蛋白表达。这表明活菌幽门螺杆菌、Hp-CS和分离的Hp-OMVs均能在HCC细胞中增加CCND1 mRNA和Cyclin D1蛋白表达。
3.5 PI3K抑制减弱Hp-OMV诱导的Cyclin D1上调和HCC细胞增殖表型
Hp-OMV暴露增加两种细胞系中PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平及Cyclin D1蛋白表达。LY294002预处理可降低Hp-OMV诱导的PI3K、AKT和mTOR磷酸化，并减弱伴随的Cyclin D1表达增加。PI3K抑制还减弱了Hp-OMV诱导的细胞周期分布变化，降低S期比例并将细胞周期分布向G0/G1期转移。此外，LY294002减弱了Hp-OMV诱导的两种细胞系集落形成增加。这些数据支持PI3K/AKT/mTOR信号通路参与Hp-OMV诱导的Cyclin D1上调、G1/S期进程和克隆生长。
四、讨论与结论总结
讨论部分指出，尽管幽门螺杆菌长期被视为胃部致癌因子，其生物学效应可能超出胃部范围。胃肠道通过门静脉循环与肝脏相连，十二指肠经胆总管和胆道树与肝脏相连，幽门螺杆菌可能经胆总管或门静脉循环到达肝脏。无菌Hp-CS尤其是分离的OMVs能够改变HCC细胞行为，表明细菌胞外产物可在无活菌同时存在的情况下发挥生物学效应。Hp-CS含有蛋白质、脂多糖、核酸和分泌型毒力相关因子的复杂混合物。OMVs可向宿主细胞递送外膜蛋白、脂多糖、毒素、酶和核酸。既往研究显示Hp-OMVs可递送VacA、CagA、尿素酶亚基等毒力相关分子，并参与胃上皮屏障破坏、炎症激活、免疫调节和胃病进展。在本研究的HCC模型中，Hp-OMVs增加细胞生长、促进G1/S期进程并增强体内肿瘤生长。PI3K抑制虽减弱了Hp-OMV诱导的Cyclin D1表达和增殖表型，但未完全消除，提示其他信号通路可能参与其中，包括MAPK、NF-κB/STAT3、Wnt/β-catenin等。研究存在以下局限：具体细菌组分尚待鉴定；皮下同基因肿瘤模型不能完全重现肝脏微环境，瘤内给药方式并非自然感染中的暴露途径；需要临床研究确定Hp来源囊泡或其组分能否在肝组织中被检测到及其与Cyclin D1表达、PI3K/AKT/mTOR活性或肿瘤行为的关联。
结论部分翻译：综上所述，研究结果表明，幽门螺杆菌来源的胞外产物可促进HCC细胞的增殖相关表型。Hp-CS增加CCND1/Cyclin D1表达并促进HCC细胞生长和肿瘤生长，而Hp-OMVs重现了这些生长相关效应并额外促进G1/S期进程。Hp-OMV暴露还激活了PI3K/AKT/mTOR信号通路，PI3K抑制可减弱Hp-OMV诱导的Cyclin D1上调、S期积累和克隆生长。这些发现表明，分离的Hp-OMVs是幽门螺杆菌具有生物学活性的胞外组分，能够影响HCC细胞行为，药理学抑制结果支持PI3K/AKT/mTOR信号通路激活和Cyclin D1上调参与其促生长效应。
