《International Journal of Molecular Sciences》：Optimizing Nystatin Biosynthesis Through Targeted Manipulation of nysL and nysGtf in Streptomyces noursei
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制霉菌素（Nystatin）是一种由诺尔斯链霉菌（Streptomyces noursei）产生的多烯大环内酯类抗真菌剂，其三种主要衍生物（制霉菌素A1、A3、聚芬净B）在C-10和C-35位点存在不同的修饰。尽管NysL与NysGtf的核心催化功能已被确立，
制霉菌素（Nystatin）是一种由诺尔斯链霉菌（Streptomyces noursei）产生的多烯大环内酯类抗真菌剂，其三种主要衍生物（制霉菌素A1、A3、聚芬净B）在C-10和C-35位点存在不同的修饰。尽管NysL与NysGtf的核心催化功能已被确立，但C-10羟基化与C-35毛地黄毒糖基化分支之间的代谢交互作用，以及工业菌株S. noursei中NysGtf的体内底物混杂性仍未被充分理解。在本研究中，研究人员构建了S. noursei 72-22-1的基因敲除、回补及过表达突变体，以表征nysL和nysGtf。虽然NysL此前已被确定为C-10羟化酶，研究人员在工业衍生菌株72-22-1中进一步阐明了其作用。nysL的敲除消除了C-10羟基化，导致制霉菌素A1/A3消失并积累了10-脱氧制霉菌素与聚芬净B，而回补和/或过表达则恢复了A1/A3的形成。nysGtf的失活阻断了C-35糖基化，使制霉菌素A1滴度提高至0.587 mg/mL，并将聚芬净B降低至0.027 mg/mL。其过表达则将制霉菌素A3产量提升至1.195 mg/mL。这些发现明确了NysL与NysGtf在制霉菌素生物合成中的生理功能，确定了聚芬净B为关键抗真菌组分，并为通过代谢工程改造S. noursei以生产高活性制霉菌素衍生物提供了可行策略。
一、研究背景与现存问题
真菌感染对全球健康构成严重威胁，侵袭性念珠菌病和曲霉病的死亡率甚至超过细菌感染，尤其在免疫受损患者和重症监护病房（ICU）患者中更为突出。制霉菌素（Nystatin），又名真菌霉素或制霉素，是一种多烯大环内酯类抗生素，于1950年首次从诺尔斯链霉菌（Streptomyces noursei）培养物中分离。其主要成分为制霉菌素A1、制霉菌素A3和聚芬净B（Polyfungin B）。这三种化合物拥有相同的结构骨架，主要区别在于C-10位的羟基基团和C-35位的毛地黄毒糖（digitoxose）部分。制霉菌素A1和A3相比聚芬净B在C-10位多一个羟基；而制霉菌素A3和聚芬净B相比制霉菌素A1则在C-35位多一个毛地黄毒糖。值得注意的是，在等质量条件下，聚芬净B的抗真菌活性显著高于制霉菌素A1和A3，因此研究聚芬净B的生物合成途径具有重要的科研价值，并为未来通过基因工程手段提高其产量奠定基础。
尽管此前研究已在S. noursei ATCC 11455中证实NysL是催化C-10羟基化的P450单加氧酶，但在工业相关突变株72-22-1中，nysL扰动如何重塑全部制霉菌素衍生物（包括聚芬净B和10-脱氧制霉菌素）的完整定量图谱尚未见报道。同时，负责C-35毛地黄毒糖转移的糖基转移酶SnNysSV的核心机制虽已建立，但该糖基转移酶变体的底物混杂性及其在工业S. noursei菌株中引起的代谢流再分配仍有待探索。此外，关于制霉菌素A3和聚芬净B的详细生物合成途径尚无文献报道，因此研究其合成及相关基因功能具有重要意义。
二、研究内容与主要结论
本研究旨在通过组合代谢工程策略，优化诺尔斯链霉菌中制霉菌素的生物合成。研究人员以Streptomyces noursei 72-22-1为亲本菌株（该菌株由Streptomyces noursei D-3-14经紫外诱变获得），针对编码P450单加氧酶的nysL基因和编码糖基转移酶的nysGtf基因，分别构建了基因敲除、回补和过表达突变体。研究发现，NysL催化C-10羟基化，将10-脱氧制霉菌素转化为制霉菌素A1；NysGtf则介导C-35毛地黄毒糖基化，负责制霉菌素A3和聚芬净B的合成。通过遗传操作，研究人员成功实现了对制霉菌素衍生物组成的定向调控：敲除nysL可阻断C-10羟基化，使代谢流转向积累高活性的聚芬净B；而过表达nysGtf则可显著提升制霉菌素A3的产量。这些结果为通过代谢工程手段生产高活性制霉菌素衍生物提供了可行策略。
三、关键技术方法
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基因操作技术：利用温敏型质粒pKC1139和整合型质粒pSET152，通过接合转移（conjugation）技术，以大肠杆菌ET12567（pUZ8002）为供体菌，将重组质粒导入S. noursei 72-22-1中，构建了nysL和nysGtf的基因敲除、回补及过表达突变体。所有突变体均通过PCR及Sanger测序验证。
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发酵产物分析与鉴定：采用高效液相色谱法（HPLC）对发酵产物进行定性和定量分析，并使用半制备型HPLC分离纯化目标产物。随后结合质谱（MS）和核磁共振波谱（NMR）对纯化后的产物进行结构确证。定量分析基于外标校准曲线，对于无商业标准的10-脱氧制霉菌素，因其与制霉菌素衍生物共享相同的四烯发色团，故以制霉菌素A1标准品为参照，设定相对响应因子为1进行计算。
四、研究结果
2.1 nysL和nysGtf基因敲除菌株的构建**
研究人员通过接合转移将敲除质粒pKC1139-LUD和pKC1139-GUD分别导入S. noursei 72-22-1，成功构建了nysL和nysGtf的敲除突变体S. noursei ΔnysL和S. noursei ΔnysGtf，并通过PCR和Sanger测序验证了双交换事件。
2.2 nysL敲除、回补和过表达菌株的发酵产物分析
HPLC分析显示，起始菌株S. noursei 72-22-1产生四种产物：制霉菌素A1（I）、制霉菌素A3（II）、10-脱氧制霉菌素（III）和聚芬净B（IV）。而nysL敲除菌株仅产生产物III和IV，完全丧失了制霉菌素A1和A3的产生能力。通过LC-MS分析，产物III被推断为10-脱氧制霉菌素，即制霉菌素A1的前体。回补菌株S. noursei ΔnysL::nysL恢复了制霉菌素A1和A3的生产，同时减少了10-脱氧制霉菌素和聚芬净B的积累。过表达菌株S. noursei::nysL的产物谱与起始菌株相似。
2.3 nysL基因对制霉菌素衍生物组成的影响
定量分析表明，在nysL敲除菌株中，制霉菌素A1和A3几乎检测不到，而10-脱氧制霉菌素的产量从0.106 mg/mL显著增加至0.844 mg/mL。这表明nysL的敲除有效降低了制霉菌素A1和A3的产量，为未来构建高产聚芬净B的菌株奠定了基础。
2.4 通过MS和NMR光谱学阐明发酵产物的结构
通过MS和NMR分析，产物I、II和IV的结构被确认为制霉菌素A1、制霉菌素A3和聚芬净B。产物III因样品量不足仅进行了MS分析，其分子量与10-脱氧制霉菌素的理论值相符。NMR数据进一步证实了各化合物的特征化学位移，例如产物IV（聚芬净B）的13C NMR谱中在38.24 ppm处出现信号，且C-8和C-12向低场位移，C-9向高场位移，表明C-10位缺乏羟基。
2.5 nysGtf基因对制霉菌素衍生物组成的影响
功能验证结果显示，敲除nysGtf基因后，制霉菌素A3的生产完全消失。同时，制霉菌素A1的产量从0.3 mg/mL升至0.587 mg/mL，10-脱氧制霉菌素从0.106 mg/mL升至0.388 mg/mL，而聚芬净B的产量则从0.353 mg/mL显著下降至0.027 mg/mL。这表明敲除nysGtf有效阻断了C-35糖基化，从而阻止了制霉菌素A3和聚芬净B的生物合成。聚芬净B产量未降至零，提示基因组中可能存在替代补偿途径。在过表达菌株S. noursei::nysGtf中，制霉菌素A3的产量从0.311 mg/mL显著提升至1.195 mg/mL，证实了nysGtf编码的糖基转移酶负责C-35毛地黄毒糖的糖基化。
五、讨论与结论总结
讨论部分要点：
本研究的讨论指出，基因敲除是阐明复杂次级代谢途径中酶精确生理功能的基石方法。通过靶向敲除nysL和nysGtf，研究人员无可争议地证明了NysL在C-10羟基化和NysGtf在C-35糖基化中的不可或缺作用。这项工作不仅确认了已知的NysL功能，更重要的是首次在工业菌株背景下提供了完整的定量代谢物数据集，并实验验证了此前仅有生物信息学预测的NysGtf的体内功能。研究揭示了NysGtf对不同途径中间体的底物偏好性，以及在糖基化受阻时代谢分支通量的重新分布。此外，成功积累并结构鉴定了关键的中间体10-脱氧制霉菌素，这在以往的菌株系统中难以获取。这些发现为理性途径工程提供了依据，例如，通过操纵已验证的遗传靶点来重定向代谢流，比随机诱变更高效。同时，敲除菌株中稀有中间体的积累为半合成修饰提供了生物来源，有望开发毒性更低的多烯类药物。
研究结论（翻译）：
在这项工作中，研究人员通过靶向基因敲除、回补和过表达，对诺尔斯链霉菌72-22-1中的两个修饰酶NysL（P450单加氧酶）和NysGtf（糖基转移酶）进行了功能鉴定。研究人员通过实验证实，在制霉菌素生物合成过程中，NysL催化C-10羟基化，而NysGtf介导C-35毛地黄毒糖基化。
与以往关于制霉菌素生物合成的研究相比，本研究提供了若干新的见解。早期的报告描述了NysL的活性，但缺乏对全部制霉菌素衍生物组的定量代谢物谱分析；尽管来自参考菌株S. noursei的其同源蛋白SnNysSV已在体外得到生化表征，但来自工业菌株S. noursei 72-22-1的C-35糖基转移酶NysGtf的体内功能在本工作之前仅停留在生物信息学预测阶段。研究人员阐明了NysGtf对不同途径中间体的底物偏好性，并揭示了糖基化阻断后代谢分支通量的重新分布。此外，研究人员成功获得了先前在其他菌株系统中难以获取的关键中间体10-脱氧制霉菌素，并对其结构进行了验证。
在实际应用方面，研究人员的基因工程策略为工业制霉菌素生产的菌种改良提供了可行路线。敲除nysL能够实现聚芬净B的高积累，后者相较于制霉菌素A1和A3具有更优的抗真菌活性，这支持了构建高产聚芬净B的工业菌株。过表达nysGtf可以特异性提高制霉菌素A3的滴度。所构建的工程突变体也为稀有多烯中间体提供了充足的生物来源，这些中间体可作为半合成修饰的起始原料，用于开发毒性更低的多烯类抗真菌衍生物。未来的工作可通过组合操纵nysL和nysGtf，并结合前体供应优化，进一步将代谢流导向所需的高活性制霉菌素衍生物，从而促进改进型多烯抗真菌药物的工业化生产。
