陆地棉(Gossypium hirsutum L.)盐超敏感3/钙调磷酸酶B类(GhSOS3)基因家族的全基因组鉴定与生物信息学表征及两个成员在干旱、盐和热胁迫下的表达谱分析

《International Journal of Molecular Sciences》：Genome-Wide Identification and In Silico Characterization of the Salt Overly Sensitive 3/Calcineurin B-like (GhSOS3) Gene Family in Upland Cotton (Gossypium hirsutum L.) and Expression Profiling of Two Members Under Drought, Salt and Heat Stress

　　

陆地棉(Gossypium hirsutum L.)是一种全球性经济作物，因其高品质纤维和富含油脂的种子而被广泛种植。多个基因家族参与植物适应不良非生物胁迫的调控通路，钙调磷酸酶B类蛋白(Calcineurin B-like, CBL)/盐超敏感3(Salt Overly Sensitive-3, SOS3)家族即为此类与植物信号转导相关的钙传感器蛋白家族。尽管GhSOS3此前已被证实与棉花盐碱胁迫响应相关，但异源四倍体G. hirsutum基因组中SOS3样基因的家族水平基因组表征尚未见报道。研究人员对GhSOS3基因家族进行了生物信息学(in silico)表征，包括基因结构、系统发育关系、蛋白质表征、选择压力、启动子元件、共线性、染色体定位及蛋白质结构建模。该分析共鉴定出5个推定GhSOS3基因。所编码蛋白质均含有保守的EF-hand相关基序，但基因结构、预测理化性质及基序组成存在差异。启动子中预测到的推定脱落酸响应元件(ABRE)、水杨酸响应元件(SARE)、干旱胁迫响应元件(DSRE)和赤霉素响应元件(GRE)提示GhSOS3基因可能对非生物胁迫相关信号具有转录响应性，但这些预测尚需实验验证。实验方面，qPCR分析显示，在三种棉花基因型中，GhSOS3-2和GhSOS3-3在干旱、盐和热胁迫处理下的转录本丰度呈现胁迫和时间依赖性变化，表明其对上述胁迫条件具有差异化转录响应。综上所述，这些发现为今后在棉花钙介导胁迫响应中开展GhSOS3候选基因的功能研究建立了基因组与表达框架。

陆地棉GhSOS3基因家族的全基因组鉴定与生物信息学表征及其胁迫响应表达研究解读

陆地棉(Gossypium hirsutum L.)是全球重要的经济作物，但其纤维产量和品质持续受到干旱、高温和盐碱等非生物胁迫的制约。植物对胁迫的感知依赖于胁迫响应基因、转运蛋白、激酶、信号分子和转录因子所组成的调控网络。其中，盐超敏感(Salt Overly Sensitive, SOS)信号转导途径是研究最为深入的离子稳态调控通路之一；在拟南芥中，SOS3（即钙调磷酸酶B类蛋白4, CBL4）作为钙结合信号转导子感知盐诱导的Ca²⁺信号，与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶SOS2(CIPK24)互作，调控质膜定位的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白SOS1，从而维持离子稳态。此前，棉花CBL家族已在基因组水平被鉴定，GhSOS3也已通过共表达网络分析和病毒诱导基因沉默(VIGS)实验被证实参与盐碱胁迫响应。然而，在异源四倍体G. hirsutum基因组中，针对SOS3样基因的家族水平基因组表征——包括染色体分布、共线性、选择压力、基因与蛋白质结构、启动子元件、预测互作伙伴及不同基因型间的胁迫响应表达——尚未见报道。棉花含有多拷贝同源基因，可能经历亚功能化或新功能化，因此GhSOS3家族是否存在亚基因组特异的复制模式、同源基因间的差异选择压力或胁迫响应表达的时序分歧仍不清楚。针对这一空白，研究人员通过多种生物信息学方法系统鉴定出5个推定GhSOS3基因，并利用qPCR分析了GhSOS3-2和GhSOS3-3在三种棉花基因型中响应干旱、盐和热胁迫的表达变化，建立了该家族的基因组与表达框架，为钙介导胁迫响应的功能研究奠定了基础。

研究方法方面，研究人员以拟南芥SOS3蛋白序列为查询序列，对G. hirsutum v3.1蛋白组(Phytozome v13)进行BLASTP搜索(E≤1×10^-10)，经NCBI-CDD、Pfam和SMART结构域验证后获得候选基因；利用GSDS、MEME、ProtParam、CELLO v2.5/WoLF PSORT、MG2C、KaKs_Calculator 2.0、MCScanX、MEGA12(JTT模型)、PlantCARE、STRING、NetPhos 3.1和AlphaFold 3分别开展基因结构、保守基序、理化性质、亚细胞定位、染色体分布、选择压力、共线性、系统发育、启动子元件、蛋白质互作、磷酸化位点及三维结构预测；表达分析基于公共RNA-seq数据(BioProject PRJNA490626)。qRT-PCR以3种陆地棉基因型(CIM-608(G1)、MNH-886(G2)、VH-295(G3)，来自棉花种质资源库)的三周龄幼苗为材料，经20% PEG(干旱)、250 mM NaCl(盐)和45°C(热)处理1、3、6 h后取样，以GhUBQ14为内参基因，采用2^-ΔΔCt法计算相对表达量。

研究结果如下：

2.1 基因结构、结构域与保守基序分析：NCBI-CDD在GhSOS3-2和GhSOS3-4中检测到FRQ1结构域(EF-hand超家族Ca²⁺结合蛋白)，在GhSOS3-1和GhSOS3-3中检测到FRQ1超家族结构域，在GhSOS3-5中检测到FRQ1超家族与EFh超家族区域；Pfam注释在所有5个蛋白质中均鉴定出EF-hand_7和EF-hand_1结构域，GhSOS3-2和GhSOS3-4另有EF-hand_5结构域。基因结构分析显示外显子最多9个、内含子最多8个，每个蛋白质最多含7个保守基序。

2.2 蛋白质理化性质与亚细胞定位：GhSOS3蛋白质预测分子量为24.33–30.12 kDa，长度为213–261个氨基酸，等电点(pI)为4.72–4.96。亚细胞定位预测显示5个蛋白质均可能定位于细胞核和细胞质；GhSOS3-1还预测定位于胞外，GhSOS3-2/-3/-4预测定位于叶绿体，GhSOS3-5预测定位于液泡和内质网，上述均为计算预测，需实验验证。

2.3 染色体定位：GhSOS3-1、-2、-3和-4分别位于A亚基因组的A01、A03、A04和A11染色体，GhSOS3-5位于D亚基因组的D05染色体，在D亚基因组对应同源染色体上未发现其他成员，呈现不均匀分布。

2.4 Ka/Ks比率与共线性：GhSOS3-1至-4间6个基因对的Ka/Ks比率均低于1(0.018–0.134)，符合纯化选择；其中两对Ks值较低(0.446和0.533)，另四对Ks>2.0，因同义位点可能饱和需谨慎解读。MCScanX检测到GhSOS3-1至-4间的共线性(同线性)关系，GhSOS3-5无共线性伙伴。

2.5 系统发育分析：基于29条氨基酸序列(780个比对位点，1000次bootstrap)构建的最大似然树显示，5个GhSOS3蛋白与拟南芥AtCBL1、AtCBL2、AtCBL6、AtCBL10及水稻OsjSOS3聚于同一分支；其中GhSOS3-1和GhSOS3-3、GhSOS3-2和GhSOS3-4分别形成两对紧密相关序列，GhSOS3-5与AtCBL10聚在一起；而AtSOS3/CBL4与BrCBL4、VrSOS3形成独立分支，表明GhSOS3蛋白并非AtSOS3/CBL4的直接直系同源物。

2.6 启动子序列分析：在2000 bp上游启动子区预测到干旱胁迫响应元件(DSRE)、MYB干旱诱导结合位点(MBS-DI)、赤霉素响应元件(GRE)、脱落酸响应元件(ABRE)、茉莉酸甲酯响应元件(MeJRE)、水杨酸响应元件(SARE)、光响应(LRE)、低温响应(LTRE)和厌氧诱导元件(ARE)等，提示GhSOS3基因可能受激素与非生物胁迫信号调控，但需实验验证。

2.7 蛋白质互作、磷酸化位点与三维结构预测：STRING预测的蛋白质互作网络含15个节点和48条边，包括CIPK8、CIPK9类似蛋白、CIPK24、CIPK24类似蛋白、非特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、DNA修复蛋白RAD4及4个未表征蛋白，属候选关联而非直接物理互作证据。AlphaFold 3预测的三维模型经Ramachandran图评估具有可接受的立体化学质量，并标注了EF-hand基序与Ca²⁺配位环残基。NetPhos 3.1预测GhSOS3-2含最多磷酸化位点(14个)。

2.8 GhSOS3基因表达分析(RNA-seq)：公共RNA-seq数据热图显示，GhSOS3-2和GhSOS3-3的整体转录水平最高，GhSOS3-5最低；GhSOS3-3在盐胁迫1 h最高，GhSOS3-2在热胁迫3 h和干旱胁迫6 h最高。

2.9 qRT-PCR表达分析：三种基因型中，GhSOS3-2和GhSOS3-3在所有胁迫处理下的转录水平均高于0 h对照。G1(CIM-608)的转录本丰度始终最高，G2(MNH-886)居中，G3(VH-295)最低。G1中GhSOS3-2在盐胁迫1 h达峰值(4.7倍)并于3 h维持4.5倍，干旱胁迫3 h(4.0倍)和热胁迫6 h(4.0倍)较高；GhSOS3-3在盐胁迫1 h达峰值(4.9倍)，所有干旱时间点均高于3.7倍，表明两个基因具有胁迫、时间和基因型依赖的差异化表达模式。

讨论与结论：讨论部分指出，GhSOS3蛋白所含EF-hand基序与钙结合能力相符，但研究未进行钙结合活性实验验证；亚细胞定位、磷酸化位点和蛋白质互作均为计算预测，预测伙伴中存在CIPK24类激酶不能作为参与经典SOS途径的证据；启动子元件仅提示转录调控可能；Ka/Ks与共线性数据不能单独确定复制机制；表达动态差异不能直接推断生物学功能差异。此外，先前VIGS沉默GhSOS3和GhCBL10可增强棉花的盐碱敏感性，而GhSOS3-5(Gohir.D05G044500)被注释为CBL10样蛋白，与先前被沉默的GhCBL10(Gh_D05G0440)均位于D05染色体，二者是否为同一基因座需通过基因组组装间的交叉比对加以确定。结论部分指出，本研究对G. hirsutum的GhSOS3基因家族进行了家族水平的全基因组in silico分析，鉴定出5个编码含EF-hand蛋白的SOS3/CBL家族基因，揭示了结构多样性、预测亚细胞定位、胁迫与激素相关顺式元件及预测互作伙伴；基因在A和D亚基因组间分布不均，4个基因存在共线性关系，Ka/Ks比率均低于1符合纯化选择，但复制机制尚未确立；qPCR实验表明GhSOS3-2和GhSOS3-3在盐、干旱和热胁迫下以胁迫、时间和基因型依赖的方式积累转录本。这些发现为棉花GhSOS3基因家族的进一步功能研究提供了基因组与表达框架，但各成员的具体生物学功能仍有待实验验证。