野生与栽培冬虫夏草代谢组差异及来源相关代谢物的预测抗肝纤维化相关性研究

《International Journal of Molecular Sciences》：Metabolomic Differences Between Wild and Cultivated Ophiocordyceps sinensis Identify Source-Associated Metabolites with Predicted Antifibrotic Relevance

　　

冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis，O. sinensis）是一种珍贵中药（traditional Chinese medicine，TCM），具有显著的保肝作用。然而，野生采集品与栽培品之间的化学差异及其与肝纤维化的关系仍未得到充分表征。研究人员联合采用非靶向超高效液相色谱–Orbitrap高分辨质谱（ultra-high-performance liquid chromatography–Orbitrap high-resolution mass spectrometry，UHPLC–Orbitrap HRMS）与靶向液相色谱–串联质谱（liquid chromatography–tandem mass spectrometry，LC–MS/MS）比较野生型（wild type，WT）与人工栽培（artificially cultivated，AC）样品。两组样品呈现不同的代谢谱，靶向分析支持所选核苷（nucleosides）、嘌呤衍生物（purine derivatives）、焦谷氨酸（pyroglutamic acid）和麦角甾醇（ergosterol）的差异。AC提取物中腺苷（adenosine）、虫草素（cordycepin）和麦角甾醇更丰富，而WT提取物中次黄嘌呤（hypoxanthine）、脱氧鸟苷（deoxyguanosine）、鸟苷（guanosine）和鸟嘌呤（guanine）更丰富。网络药理学（network pharmacology）将所选来源相关代谢物与158个纤维化相关候选靶点关联，并优先识别以激酶为中心的网路，涉及表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src（proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src，SRC）、蛋白酪氨酸激酶2（protein tyrosine kinase 2，PTK2）、HRas原癌基因GTP酶（HRas proto-oncogene, GTPase，HRAS）、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K-Akt）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号。分子对接（molecular docking）和重复分子动力学模拟（replicated molecular dynamics simulations）表明，尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺（uridine diphosphate N-acetylglucosamine，UDP-N-acetylglucosamine）与HRAS及AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1（AKT serine/threonine kinase 1，AKT1）的复合物、麦角甾醇与SRC的复合物具有结构上合理的相互作用。这些发现揭示所分析WT与AC样品之间存在来源相关代谢差异，并为其在肝纤维化调控中可能的不同作用提供机制线索，尚需进一步实验验证。

研究背景与问题：冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis，O. sinensis）为珍贵中药（traditional Chinese medicine，TCM），具保肝作用。野生资源因生态扰动、过度采挖、长生命周期和自然更新有限而下降，人工栽培（artificially cultivated，AC）及其他虫草产品提供替代资源。冬虫夏草化学组成受生长环境影响，野生型（wild type，WT）与AC在宿主及环境微生物群落等生态条件不同，可能影响代谢过程与代谢物积累；已有研究表明AC若干主要成分与WT水平相当，但有限标志物相似不能证明整体化学组成或药理活性等价，需更广泛比较。肝纤维化（liver fibrosis）是慢性肝损伤的病理伤口愈合反应，特征为持续炎症、肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）活化、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度沉积与重塑。既往临床和实验研究提供冬虫夏草抗纤维化探索依据：初步临床研究报告慢性乙型肝炎患者纤维化血清标志物改善；实验研究显示冬虫夏草减轻四氯化碳（CCl₄）加乙醇诱导的大鼠肝纤维化；栽培菌丝多糖减轻CCl₄诱导肝纤维化并降低HSC活化、调节转化生长因子β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）/Smad信号；栽培菌丝减轻硫代乙酰胺诱导大鼠肝损伤炎症和纤维化相关变化；栽培菌丝来源麦角甾醇在CCl₄处理小鼠和活化LX-2人HSC中显示抗纤维化活性。但既往多聚焦制剂或单成分药理，野生与AC组成差异是否对应不同候选抗纤维化成分及分子靶点–通路相互作用尚未系统研究。因此研究人员以代谢组学、网络药理学和分子动力学（molecular dynamics，MD）模拟连接来源相关化学差异与预测抗纤维化成分谱及分子相互作用。

研究人员开展研究，结论意义：采用UHPLC–Orbitrap HRMS非靶向代谢组比较WT与AC，独立样本靶向UPLC–MS/MS定量所选代谢物，并在肝纤维化背景下进行网络药理学和功能富集，对代表性代谢物–靶点对进行分子对接和MD模拟。结论显示两组代谢谱不同，靶向分析支持所选核苷、嘌呤衍生物、焦谷氨酸和麦角甾醇差异；AC中腺苷、虫草素、麦角甾醇更高，WT中次黄嘌呤、脱氧鸟苷、鸟苷、鸟嘌呤更高。网络药理学将来源相关代谢物与158个纤维化相关候选靶点关联，优先识别以激酶为中心的EGFR/SRC/PTK2–HRAS–PI3K-Akt/MAPK信号网络；对接和重复MD提示UDP-N-acetylglucosamine与HRAS、AKT1及ergosterol与SRC复合物具有结构上合理相互作用。其意义在于揭示WT与AC来源相关代谢差异及其在肝纤维化调控中可能不同作用的机制线索，属需进一步实验验证的假设。

关键技术方法：WT样品于2025年6月采自西藏自治区那曲市嘉黎县，AC样品同年购自西藏自治区拉萨市药材市场药店；非靶向代谢组每组6个生物学重复，靶向定量独立样本每组5个重复。方法包括UHPLC–Orbitrap HRMS非靶向代谢组、UPLC–MS/MS靶向定量、SwissTargetPrediction/PharmMapper/DGIdb靶点预测、OMIM/GeneCards疾病靶点、STRING蛋白–蛋白相互作用（protein–protein interaction，PPI）网络、Cytoscape/cytoHubba/MCODE分析、DAVID基因本体（Gene Ontology，GO）与京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集、AutoDock Vina 1.2.0分子对接及多副本MD与IGMH分析。

研究结果：
2.1 UHPLC-Orbitrap HRMS代谢谱揭示AC与WT冬虫夏草存在明显化学差异。质控样品正负离子模式总离子流色谱峰保留时间和分布一致；相关分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判别分析和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）显示组内聚集、组间分离；置换检验中原始Q²高于置换模型，说明代谢谱差异稳定。
2.2 差异代谢物谱揭示AC与WT冬虫夏草间显著化学差异。差异代谢物以脂质和类脂分子最多，其次为氨基酸衍生物和生物碱相关化合物；热图显示组间模式不同；共鉴定2193个差异代谢物，AC相对WT上调832个、下调1361个。KEGG富集主要包括ATP结合盒（ATP-binding cassette，ABC）转运体、氨基酸生物合成、D-氨基酸代谢、代谢通路、氨酰-tRNA生物合成、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢、赖氨酸降解、亚油酸代谢、精氨酸生物合成、嘌呤代谢等，提示脂质、氨基酸衍生物和核苷酸相关通路差异。
2.3 药理活性代谢物鉴定与定量验证。8个代谢物以标准品靶向LC–MS/MS在独立样本中定量，7个差异显著。AC中腺苷、虫草素和麦角甾醇较高，WT中次黄嘌呤、脱氧鸟苷、鸟苷和鸟嘌呤较高；焦谷氨酸在AC数值较高但差异未达显著。
2.4 潜在治疗靶点与关键枢纽靶点识别。基于差异代谢、靶向验证、数据库注释和文献相关性，选8个候选代谢物：adenosine、UDP-N-acetylglucosamine、pyroglutamic acid、hypoxanthine、N-acetyl-D-glucosamine、ergosterol、guanosine、cordycepin。预测534个化合物相关靶点，收集3254个肝纤维化相关靶点，Venn得158个重叠候选靶点；构建代谢物–靶点网络和PPI；cytoHubba五算法整合筛选12个枢纽靶点：SRC、AKT1、EGFR、MAPK1、PTK2、HRAS、RAF1、PTPN11、HSP90AA1、ESR1、JAK2、MET。
2.5 功能富集识别以激酶为中心通路。158靶点KEGG富集于癌症通路、癌症蛋白聚糖、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药、PI3K-Akt、脂质与动脉粥样硬化、FoxO、AGE–RAGE、MAPK、Ras、Rap1等；GO涉及信号转导、转录调控、蛋白磷酸化、激酶介导信号、炎症反应、细胞增殖和迁移。12枢纽靶点涉及EGFR信号、MAPK级联、蛋白自磷酸化等，KEGG涉及Rap1、趋化因子、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、PI3K-Akt、黏着斑、ErbB等。MCODE模块1含EGFR、PTK2、JAK2、STAT1、PTPN11，模块3含FGFR1、FGFR2、SRC、HRAS、HSP90AA1、MAPK1、AKT2，支持生长因子受体相关激酶信号网络与抗纤维化潜力预测相关。
2.6 分子对接与分子动力学模拟。34个配体–靶点对对接成功，Vina分数?4.1至?10.3 kcal/mol，13个≤?7.0；UDP-N-acetylglucosamine对HRAS、AKT1、EGFR较优，ergosterol对HRAS、SRC、AKT1较优。选HRAS–UDP-N-acetylglucosamine、AKT1–UDP-N-acetylglucosamine、SRC–ergosterol进行三副本MD；蛋白骨架RMSD约25 ns后趋稳，R_g稳定。HRAS复合物中Val14、Gly15、Lys16主链氮与磷酸氧形成氢键，Ala145、Lys146与远端氧作用；AKT1复合物中Trp80呈近平行堆积样作用，Gln79 OE1形成分叉氢键，Arg273、Glu298、Tyr18参与；SRC–ergosterol以疏水和范德华接触为主，邻近Thr338、Ala390、Leu393。IGMH显示HRAS–UDP-N-acetylglucosamine界面最广，AKT1次之，SRC–ergosterol较局限，支持网络药理学预测。

讨论总结：既往已报道野生与栽培冬虫夏草代谢差异；本研究鉴定2193个差异代谢物，靶向定量证实腺苷、虫草素、麦角甾醇在AC较高，次黄嘌呤在WT较高，焦谷氨酸AC较高但未显著，脱氧鸟苷、鸟苷、鸟嘌呤趋势与非靶向一致。肝纤维化背景下，虫草素已有减轻肝脂肪变性、炎症和纤维化、经AMPK相关信号、抑制谷氨酰胺分解、诱导HSC衰老及调节SOX9/Wnt/β-catenin轴的报道；既往比较多聚焦化学组成，来源差异是否转化为不同抗纤维化机制不清楚。网络药理和富集提示多成分多靶点，重叠靶点富集于PI3K-Akt、MAPK、Ras、Rap1、ErbB、VEGF、黏着斑、趋化因子、JAK–STAT等；对接显示UDP-N-acetylglucosamine和ergosterol与HRAS、AKT1、SRC、EGFR、PTK2等有较好预测结合，MD显示代表性构象在稳定蛋白构象系综中维持并由持续非共价作用支持，支持EGFR/SRC/PTK2–HRAS–PI3K-Akt/MAPK轴作为假设生成框架。AC富集代谢物与激酶中心网络预测关联更强；WT有较高次黄嘌呤及γ-linolenic acid、N-acetyl-D-glucosamine、D-mannitol、deoxyguanosine、guanosine、guanine，其中γ-linolenic acid与EGFR预测结合较好。讨论部分强调不能解释为AC抗纤维化疗效优于WT；AC样品来自商业来源而非课题组直接栽培，栽培条件、批次和产地差异可能影响代谢差异；需独立表征样本及细胞/动物模型验证；UDP-N-acetylglucosamine仅作探索性通路分析，作为高极性带负电核苷糖不易被动扩散跨膜，未被视为具确定细胞可及性或直接抗纤维化活性候选。

研究结论（翻译）：本研究揭示AC与WT冬虫夏草之间存在明确代谢差异，并通过对所选代谢物的靶向定量进一步支持。整合网络药理学、功能富集、分子对接和MD模拟进一步表明，AC与WT的不同代谢物谱可能对应不同靶点关联和机制特征。AC中富集的代谢物显示与以激酶为中心信号网络更强的预测关联，尤其是EGFR/SRC/PTK2–HRAS–PI3K-Akt/MAPK轴，而WT呈现不同的代谢物相关网络模式。这些发现提示来源依赖的代谢变异可能促成野生采集与栽培冬虫夏草之间的不同生物学特性，为理解其潜在功能差异提供基础。