口服免疫耐受诱导联合序贯AAV9/AAV8基因治疗黏多糖贮积症IVA型的研究

《International Journal of Molecular Sciences》：Induction of Oral Immune Tolerance Enables Sequential AAV9/AAV8 Gene Therapy in Mucopolysaccharidosis IVA

　　

黏多糖贮积症IVA型（MPS IVA）由N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶（GALNS）缺乏所致，导致硫酸角质素进行性蓄积，现有疗法疗效有限。尽管腺相关病毒（AAV）基因治疗可恢复系统性酶活性，但针对转基因产物及病毒衣壳的免疫应答限制了疗效的持久性，并阻碍载体再次给药。研究人员评估了抗原特异性口服免疫耐受与序贯AAV血清型递送相结合的联合策略。新生MPS IVA小鼠隔日口服三种GALNS免疫优势T细胞和B细胞表位混合物，持续20天，随后于4周龄接受AAV9注射，并于10周龄以AAV9或AAV8再次给药。经肽处理的耐受化MPS IVA小鼠在首次给药后循环GALNS活性提高2–3倍，再次给药后提高7–8倍，而未耐受化MPS IVA小鼠则产生抗GALNS抗体，使酶水平降低。AAV9与AAV8之间未检测到交叉反应性中和抗体。经肽处理的小鼠血浆和肝脏硫酸角质素（KS）水平恢复正常，骨骼和心脏组织病理学显著改善，其中肽处理AAV9→AAV8组获益最大。上述发现表明，口服免疫耐受可实现安全的AAV再给药，增强系统性酶生物利用度，并改善组织纠正效果，为MPS IVA的持久治疗提供了可临床转化的策略。

研究背景与问题

黏多糖贮积症IVA型（MPS IVA，即Morquio A综合征）是由GALNS基因致病性变异引起的常染色体隐性溶酶体贮积症，GALNS酶缺乏导致硫酸角质素（KS）和硫酸软骨素-6-硫酸（C6S）降解障碍，糖胺聚糖（GAG）在软骨细胞和结缔组织中进行性蓄积。临床主要表现为身材矮小、严重骨骼发育不良、关节过度活动、气道阻塞、角膜混浊和限制性肺病。与其他MPS亚型不同，Morquio A主要累及骨骼系统，软骨无血管供应且结缔组织代谢需求高，治疗难度大。现有酶替代疗法（ERT）虽可降低系统性GAG负荷并适度改善耐力，但对骨骼病变效果有限，且需终身每周输注，常诱发抗药抗体和T细胞介导的免疫应答，加速酶清除。造血干细胞移植（HSCT）受供体来源、移植物抗宿主病、移植物失败及对骨骼疾病获益有限等限制。AAV介导的基因治疗可提供持续系统性酶供应，但针对GALNS转基因产物和病毒衣壳的免疫应答，包括中和抗体（NAbs）和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应，严重限制疗效持久性和载体再给药。高剂量AAV给药还可能引发肾小球肾炎等严重不良事件，而传统免疫抑制方案未能可靠降低这些风险。此外，儿科肝脏生长和肝细胞更新导致载体基因组稀释，可能需要再次给药，但初次暴露后快速诱导的血清型特异性NAbs会阻断同血清型再转导。因此，需要既能抑制转基因产物免疫应答又能规避衣壳中和的联合策略。

研究内容与结论

研究人员在新生MPS IVA小鼠（Galns^?/? KO，C57BL/6背景）中，于出生后72小时内隔日口服三种GALNS免疫优势肽（C4、E8、I10）混合物或单一肽（I10），剂量3 μg/g体重，持续20天；4周龄时尾静脉注射5×10¹³基因组拷贝/kg的AAV9载体（CAG-AAV9-hGALNS），10周龄时再次给予同剂量AAV9或AAV8。共设9组：三种肽+AAV9→AAV8、三种肽+AAV9→AAV9、单肽I10+AAV9→AAV9、单肽I10+AAV9→AAV8、单次AAV9、AAV9→AAV9、AAV9→AAV8、未处理野生型（WT）和未处理MPS IVA对照。结果显示，三种肽联合AAV9→AAV8组血浆GALNS活性最高且最持久，较野生型对照提高8倍以上；三种肽联合AAV9→AAV9组维持稳定酶活性，终点提高4倍。未耐受组虽出现超生理水平酶活性，但低于三种肽联合AAV9→AAV8组。肝脏中，三种肽联合双剂量组酶活性较野生型提高35–40倍；肺、心脏、肌肉中三种肽联合AAV9→AAV8组酶活性最高；骨骼中仅AAV9→AAV9和AAV9→AAV8组酶活性与野生型无显著差异，免疫耐受组中仅三种肽联合AAV9→AAV8组检测到GALNS活性。抗体检测显示，三种肽处理组在整个观察期抗GALNS IgG极低，而未耐受组自AAV注射后2周起抗体升高，16周达峰后逐渐下降，抗体水平与血浆酶活性呈反比。单一肽I10组虽抗体水平较低，但酶活性未提高，提示耐受印记不足。细胞免疫方面，免疫耐受组脾细胞IL-10分泌细胞数显著高于未耐受组，IL-2和IL-4分泌细胞数显著降低。衣壳抗体方面，AAV9与AAV8之间未检测到交叉反应性抗体，序贯异源血清型给药可规避NAb介导的再给药抑制。KS水平方面，所有治疗组血浆、肝脏和骨骼KS均恢复至野生型水平。组织病理学上，三种肽联合AAV9→AAV8组心脏空泡化完全纠正，骨骼生长板柱状结构改善最明显，胫骨和股骨生长板软骨细胞大小仅在免疫耐受双剂量组恢复正常。micro-CT显示三种肽联合AAV9→AAV8组骨小梁和皮质参数及骨密度接近野生型。载体生物分布显示，同源AAV9二次给药后肝脏、耳、肺和骨骼肌载体拷贝数最低，提示第二次AAV9给药后诱导了抗AAV9中和抗体；而AAV9→AAV8序贯给药组上述组织载体拷贝数更高。安全性方面，各组AST和ALT均处于正常生理范围，未观察到肝毒性。

关键技术方法

研究使用了以下主要技术方法：MPS IVA小鼠模型（Galns^?/? KO，C57BL/6背景，靶向删除GALNS基因外显子2）；口服肽耐受诱导（新生小鼠隔日口服C4、E8、I10肽混合物或单一I10肽，3 μg/g体重，持续20天）；AAV载体构建与给药（CAG启动子驱动密码子优化的hGALNS转基因，包装为AAV9和AAV8，尾静脉注射5×10¹³ GC/kg）；ELISA检测抗GALNS和抗AAV抗体；ELISPOT检测IL-2、IL-4、IL-10分泌细胞；GALNS酶活性荧光测定；LC-MS/MS定量血浆和组织KS；甲苯胺蓝染色组织病理学评分；micro-CT骨形态计量分析；数字PCR（dPCR）定量载体基因组拷贝数。

研究结果

2.1 口服肽诱导免疫耐受联合序贯AAV递送增强GALNS活性：三种肽联合AAV9→AAV8组血浆酶活性最高且最持久，较野生型提高8倍以上；肝脏中免疫耐受双剂量组酶活性提高35–40倍；肺、肌肉中该组酶活性最高；骨骼中仅双剂量组酶活性接近野生型。

2.2 肽诱导免疫耐受抑制抗GALNS抗体形成：三种肽处理组抗GALNS IgG极低，未耐受组抗体升高并与酶活性呈反比，单一肽组抗体低但酶活性未改善。

2.3 细胞介导免疫调节：免疫耐受组IL-10分泌细胞增加，IL-2和IL-4分泌细胞减少，与体液免疫谱一致。

2.4 序贯AAV给药避免交叉反应性抗衣壳应答：AAV9与AAV8间无交叉反应性抗体，同源AAV9二次给药诱导较高抗AAV9 IgG，异源序贯给药支持再转导。

2.5 KS贮积的生化纠正：所有治疗组血浆、肝脏和骨骼KS均恢复至野生型水平。

2.6 骨骼和心脏组织病理学改善：三种肽联合AAV9→AAV8组心脏空泡化完全纠正，骨骼生长板改善最明显，软骨细胞大小仅在免疫耐受双剂量组恢复正常。

2.7 不良效应：AST和ALT均在正常范围，无肝毒性；免疫耐受双剂量组体重自18周起稳定，与野生型和未处理MPS IVA小鼠均有显著差异。

2.8 micro-CT骨形态计量：三种肽联合AAV9→AAV8组骨小梁参数和骨密度接近野生型，其他治疗组仅部分纠正。

2.9 AAV基因组生物分布：同源AAV9二次给药组载体拷贝数最低，提示中和抗体介导的清除；AAV9→AAV8序贯组载体拷贝数更高。

讨论与结论

讨论部分指出，抗原特异性口服耐受有效抑制了抗GALNS体液免疫，IL-10优势、IL-2/IL-4低下的细胞因子谱支持调节性通路诱导。单一肽耐受印记不足以维持治疗获益，而多肽联合暴露可提供更广泛的表位覆盖。血清型转换策略利用AAV血清型间有限的交叉反应性，规避衣壳介导的中和，支持高剂量重复给药替代单次高剂量方案。免疫耐受联合异源序贯给药在心脏和骨骼组织获得一致的生化和组织病理学纠正。研究局限性包括物种间耐受诱导和AAV免疫原性差异、口服耐受在年长儿童和成人中的持久性未知、多次血清型转换的可行性待验证，以及人类HLA高度多态性可能需要患者特异性表位设计。未来需在大动物模型中确定最佳时机、剂量和血清型序列，评估长期安全性，并探索抗原特异性耐受与衣壳靶向免疫调节的联合策略。结论部分总结：选择性转基因特异性耐受联合血清型转换再给药，为受免疫屏障和组织更新限制的儿科酶缺乏症提供了可推广、可临床操作的重复AAV给药框架，支持Morquio A综合征的转化推进。