儿童正常C1抑制剂遗传性血管性水肿的诊断挑战、MYOF、F12和HS3ST6的新突变及生物信息学分析的作用

《International Journal of Molecular Sciences》：Hereditary Angioedema with Normal C1-Inhibitor in Children: Diagnostic Challenges, Novel Mutations in MYOF, F12, and HS3ST6, and the Role of Bioinformatics Analysis

　　

遗传性血管性水肿伴正常C1抑制剂（HAE-nC1INH）缺乏经过验证的生物化学标志物，这使诊断及对罕见遗传变异（尤其在儿童中）的解释变得复杂。为了改善儿科HAE-nC1INH的分子特征描述，研究人员对23名患有复发性非组胺能性血管性水肿、C4和C1抑制剂水平正常且无致病性SERPING1变异的儿童进行了研究。所有23名患者均接受了全外显子组测序（WES），随后对候选变异进行了整合性的计算机模拟评估。在一名患者中发现了一个罕见的杂合性MYOF p.Arg1590Gln变异，并将其归类为意义未明变异（VUS），计算分析表明其可能具有功能相关性。在两名无亲缘关系的患者中发现了纯合性F12 p.Ala207Pro；然而，其较高的人群频率和ClinVar中的良性分类不支持其致病作用。在五名患者中检测到四种HS3ST6错义变异；其中p.Pro199Leu显示出最强的潜在功能相关性计算证据，而其余变异的临床意义仍不确定。这些发现扩展了儿科HAE-nC1INH的分子谱系，并支持将测序与相关基因变异优先级排序相结合。在临床应用前，需要通过功能研究来确认其因果关系。

一、研究背景

遗传性血管性水肿（HAE）是一种罕见的遗传性疾病，其特征为反复发作、通常自限性的局部肿胀，累及皮肤、皮下组织、胃肠道及上呼吸道。尽管其发病率较低，但HAE给患者带来了显著的临床和人文负担，包括疼痛、日常活动受限、工作效率降低及生活质量受损。喉头水肿是最严重的表现，因为进行性上气道阻塞若未能及时获得疾病特异性治疗，可能导致致命性窒息。在特征最明确的HAE类型中，肿胀源于缓激肽过度生成、缓激肽B2受体激活及随之而来的血管通透性增加。这一机制将HAE与肥大细胞介导的血管性水肿区分开来，后者主要由组胺等介质主导。因此，抗组胺药、全身性糖皮质激素和肾上腺素对确诊的缓激肽介导的发作无效。大多数HAE病例由SERPING1基因的致病性变异引起，导致C1抑制剂定量缺乏（HAE-1型）或功能活性降低（HAE-2型）。然而，有一类独特的临床和遗传学群体，即患者在C1抑制剂浓度和功能均正常的情况下仍出现复发性血管性水肿，这类疾病现被命名为正常C1抑制剂遗传性血管性水肿（HAE-nC1INH）。

目前，HAE-nC1INH的诊断面临巨大挑战。常规补体检测通常无异常，且缺乏普遍验证、敏感且特异的实验室生物标志物。诊断评估需整合临床表现和家族史，排除肥大细胞介导、药物诱发及获得性血管性水肿，并进行分子遗传学检测。此外，不完全外显率、可变表达度以及关于各亚型机制和治疗反应的有限证据进一步增加了不确定性。分子研究表明，HAE-nC1INH存在显著的遗传异质性，其遗传亚型与F12、PLG、ANGPT1、KNG1、MYOF和HS3ST6等基因的致病性或假定致病性变异相关。然而，支持单个基因的证据强度差异很大，许多基于单一家族或小型队列的研究缺乏充分的功能验证，且相当一部分具有典型临床表型的患者无法在已知HAE相关基因中找到致病性变异。这表明HAE-nC1INH的遗传结构尚不完全清楚，可能存在更多尚未鉴定的基因、调控变异或寡基因/多因素机制参与内皮功能障碍和血管通透性调节。

在儿童期诊断HAE更具挑战性。周围性肿胀和复发性腹痛是非特异性的，常被误诊为过敏、胃肠或外科疾病。对于HAE-nC1INH，正常的常规补体结果以及关于各遗传亚型年龄依赖性外显率和自然史的有限信息，加剧了诊断的不确定性。大多数已发表的儿科证据涉及C1抑制剂缺乏引起的HAE，而儿科HAE-nC1INH的临床谱系和遗传多样性仍鲜有描述。因此，受影响的儿童可能会经历反复检查和住院，并接受不针对根本疾病机制的治疗。鉴于上述问题，有必要对儿科HAE-nC1INH队列进行系统的分子遗传学研究，以鉴定新的致病或候选变异，并探索其潜在的功能意义。

二、研究目的与研究结论

为改善儿科HAE-nC1INH的分子特征描述，本研究对23名符合纳入标准的患儿进行了全外显子组测序（WES），并结合整合性的生物信息学框架对候选变异进行评估。研究结论如下：

1. 1.
   在23名患者中，有8名（34.8%）被鉴定出值得优先评估的变异。在MYOF基因中发现了一个此前未报道的杂合错义变异p.Arg1590Gln，经ACMG/AMP标准分类为意义未明变异（VUS），但多项计算分析一致提示其可能具有功能相关性。
2. 2.
   在两名无亲缘关系的患者中发现了F12基因的纯合错义变异p.Ala207Pro。然而，该变异在普通人群中频率较高，在ClinVar中被归类为良性，且不同计算工具的预测结果不一致，因此不被认为是本研究中HAE-nC1INH的致病变异。
3. 3.
   在五名患者中鉴定出四种HS3ST6基因的错义变异。其中，p.Pro199Leu显示出最强的潜在功能相关性计算证据，而其他变异（p.Ala163Val, p.Ala192Thr, p.Leu316Val）的临床意义尚不确定。
   这些发现扩展了儿科HAE-nC1INH的分子谱系，并支持将测序与相关基因变异的优先级排序相结合。研究强调，计算分析可用于假设生成和变异优先级排序，但不能独立确立致病性，最终解释需要更大规模对照队列、家系共分离分析和变异特异性功能研究。

三、主要技术方法

1. 1.
   研究对象与样本来源：研究纳入了23名年龄2至14岁的儿科患者，来自俄罗斯的医疗中心。所有患者均表现出符合HAE的临床表型，但血清C4浓度、C1抑制剂定量及功能正常，且无致病性SERPING1变异。
2. 2.
   全外显子组测序（WES）：对所有23名患者的外显子组进行测序，使用Illumina NextSeq 500平台，平均目标覆盖深度为70-100×。原始数据通过DRAGEN Bio-IT平台处理，比对至GRCh37/hg19人类参考基因组。
3. 3.
   生物信息学分析与变异优先级排序：采用整合的计算框架评估候选变异，包括：使用PolyPhen-2、PROVEAN、MutationTaster2021等多种工具预测氨基酸替换的致病性；利用MUpro、I-Mutant2.0、DUET等算法评估蛋白质稳定性变化（ΔΔG）；通过ConSurf和PANTHER分析进化保守性；使用HOPE和PremPS进行结构建模；利用MutationTaster2021预测剪接位点影响。人群等位基因频率来源于gnomAD和dbSNP，临床注释检索自ClinVar。变异解释遵循ACMG/AMP指南。

四、研究结果

2.1 队列的人口统计学和临床特征

所有23名患者均未携带致病性SERPING1变异。WES在8名患者（34.8%）中鉴定出待评估的候选变异，其中女性占60.9%，中位年龄为8岁。34.8%的患者有阳性家族史。首次临床表现多发生在10岁以内（69.6%），中位发病年龄为6岁。最常见的首发表现为皮下血管性水肿（56.5%），其次为腹部发作（43.5%）。在整个病程中，复发性外周血管性水肿最为常见（60.9%），腹部发作次之（52.2%）。值得注意的是，有2名患者因腹部发作被误诊为急腹症而接受了不必要的手术干预。这表明儿科HAE-nC1INH临床表现高度异质，腹部等非典型表现构成诊断挑战。

2.2 新型MYOF变异的鉴定与计算机模拟表征

通过WES，在一名14岁女孩中发现了一个此前未报道的杂合MYOF错义变异p.Arg1590Gln。该患者表现为复发性手部周围性血管性水肿、需反复住院的可疑急腹症以及阳性家族史。该变异在人群中极为罕见（MAF=6×10^-5）。Arg1590残基在脊椎动物中高度保守。结构建模预测p.Arg1590Gln会破坏局部相互作用网络，包括丢失与Tyr1593的氢键以及干扰与Asp1631和Glu1588的离子相互作用。多个蛋白质稳定性算法一致预测该突变会导致蛋白去稳定化（ΔΔG约-1.21 kcal/mol）。多种致病性预测工具（如PolyPhen-2、PhD-SNPg、MutationTaster2021）均支持该变异的有害性。根据ACMG/AMP标准，该变异被分类为VUS（PP3证据级别）。

2.3 F12变异的鉴定与计算机模拟表征

在两名无亲缘关系的患者（一名13岁女童和一名2岁男童）中发现了F12基因的纯合错义变异p.Ala207Pro，两者均主要表现为唇舌复发性血管性水肿和间歇性腹痛。Ala207位于EGF样2结构域。结构预测认为脯氨酸替代会增大残基体积并改变疏水性，可能破坏局部构象。稳定性分析一致预测该突变会降低蛋白质稳定性（ΔΔG范围-0.54至-1.63 kcal/mol）。剪接位点分析预测该变异可能增强供体剪接位点。然而，致病性预测在不同算法间存在分歧。更重要的是，该变异在普通人群中频率较高，且在ClinVar中针对HAE 3型被归类为良性。因此，p.Ala207Pro不被认为是本研究的致病变异，其在患者中的检出应视为共存现象而非因果证据。

2.4 HS3ST6变异的鉴定与计算机模拟表征

在五名无亲缘关系的患者中鉴定出四种不同的HS3ST6错义变异。最常见的是p.Leu316Val（rs337285），在三名患者中检出。一名患者携带罕见的p.Pro199Leu变异（MAF=0.001111）。综合计算分析显示，p.Pro199Leu位于高度保守的功能域，并被多个算法一致预测为有害，同时预测会导致蛋白质去稳定化（ΔΔG=-1.27 kcal/mol），显示出最强的潜在功能相关性证据。相比之下，p.Ala163Val、p.Ala192Thr和p.Leu316Val被预测为中性或仅有轻微功能效应。因此，p.Pro199Leu被视为优先候选变异，而其他变异则被认为是候选易感性或可能的修饰性变异，其临床意义有待进一步验证。

五、讨论总结

研究人员首先讨论了儿童HAE-nC1INH的诊断挑战。由于缺乏生化标志物，诊断依赖于仔细的临床表型分析和分子遗传学检测。本队列中的所有患者均对抗组胺药和糖皮质激素无效，这支持非组胺能机制，但并不能单独确立缓激肽介导的诊断。特别是MYOF和HS3ST6相关形式被认为涉及血管内皮功能异常而非明确的缓激肽依赖机制。因此，在排除肥大细胞介导和其他原因后，对出现复发性血管性水肿、腹部发作或喉头水肿的儿童进行早期分子遗传学检测具有重要意义。变异解读是关键难题，研究人员采用了分层解释框架，将计算证据作为支持性证据，结合人群频率、家系共分离、临床表型和已有文献进行综合判断。

关于MYOF p.Arg1590Gln，该变异被分类为VUS。虽然其生物学合理性（myoferlin参与膜修复、囊泡运输和内皮屏障调节）提供了有趣的机制背景，但基因水平的合理性不能外推至特定变异的致病性。需要功能性研究和家系分析才能重新分类。

关于F12 p.Ala207Pro，该变异不同于已明确的HAE相关F12致病性变异（如Thr328突变）。尽管计算分析提示可能的结构和剪接效应，但预测结果不一致，且缺乏功能性证据证明其能增强FXII激活或缓激肽生成。其较高的人群频率不支持其为高外显率的独立致病变异。

关于HS3ST6变异，p.Pro199Leu显示出最强的计算证据，但仍是候选变异。其他三个变异（p.Ala163Val, p.Ala192Thr, p.Leu316Val）的支持证据更弱，被视为候选易感性或可能的修饰性变异。所有这些都需要更大规模的病例对照研究、家系分析和功能实验来阐明其作用。

最后，研究人员指出了研究的局限性：样本量小、缺乏匹配的健康对照组、存在转诊偏倚、家系共分离分析不完整、完全依赖计算方法而无功能验证、WES技术本身无法检测所有类型的变异（如调控区、深部内含子变异、结构重排等）。因此，研究结论应谨慎解读，所提出的变异功能后果均为暂时性的，需要实验验证。

六、研究结论翻译

HAE-nC1INH仍然是一种遗传异质性强且诊断困难的疾病，尤其在儿童中，因为缺乏经过验证的生化标志物。因此，在排除了C1抑制剂缺乏和其他相关复发性血管性水肿病因后，分子遗传学检测成为诊断评估的重要组成部分。在这个儿科队列中，研究人员在MYOF、F12和HS3ST6基因中鉴定出了变异，但其临床意义差异很大。MYOF p.Arg1590Gln根据ACMG/AMP标准被分类为VUS，应被视为候选变异而非确定的致病原因。F12 p.Ala207Pro在两名受影响患者中被发现；然而，其人群频率、不一致的计算预测以及缺乏功能性证据，基于现有数据不支持其致病作用。在HS3ST6变异中，p.Pro199Leu显示出最强的计算证据，值得进一步研究，而p.Ala163Val、p.Ala192Thr和p.Leu316Val应被视为候选易感性或假定的修饰性变异，其临床效应尚未确定。这些发现强调了变异鉴定、计算优先级排序与疾病因果证据之间的区别。计算机模拟分析可以优先筛选候选变异并产生可实验验证的假设，但不能独立确立致病性或修饰效应。确切的解释将需要更大规模、适当对照的队列、家系共分离分析和变异特异性功能研究。另一个局限是所有变异阳性患者缺乏标准化的个体水平表型分析，这阻碍了稳健的基因型-表型关联分析。未来需要前瞻性研究，将发作特征、治疗反应、家族史和实验室参数的系统评估与基因组和功能数据相结合，这对于定义儿科HAE-nC1INH中候选变异的临床相关性至关重要。