春小麦农艺性状全基因组关联分析（GWAS）分子标记与优良种质——哈萨克斯坦北部和西伯利亚KASIB核心种质研究

《International Journal of Molecular Sciences》：Molecular Markers of Agronomic Traits and Superior Germplasm of Spring Wheat in Northern Kazakhstan and Siberia

　　

春小麦（Triticum aestivum L.）是横跨哈萨克斯坦北部、乌拉尔和西西伯利亚的广阔雨养地区的主要作物，其生产力受水分胁迫、病害以及传统育种中基因组工具采用缓慢的限制。研究人员对来自哈萨克斯坦—西伯利亚春小麦改良网络（Kazakhstan–Siberia Network for Spring Wheat Improvement, KASIB）的142份春小麦基因型开展了全基因组关联分析（genome-wide association study, GWAS），并于2020—2022年在俄罗斯和哈萨克斯坦的4个站点进行评价。该分析鉴定出23个显著标记—性状关联（单核苷酸多态性，single nucleotide polymorphism, SNPs），其中21个至少在两个环境中稳定，11个对两个或更多性状表现出多效性。籽粒产量与两个SNP（1A_12366171_G_A和1B_15284504_C_T）相关，且二者均影响抽穗和成熟。抽穗和成熟受1B、2B、5A和7B染色体上SNP簇控制，效应最高达5.1天。株高与1A、5A和6B上的SNP相关，包括一个与千粒重具有多效性的标记（5A_585412831_A_G）。穗部生产力与1A、3D、4A、4D、5B和7B上的位点相关（穗粒重和每穗粒数、每穗小穗数以及穗收获指数）。籽粒大小和千粒重与1B、5A和6B上的SNP连锁，蛋白质和面筋含量与3A和4B上的两个位点相关，使蛋白质最高提高0.62%、面筋最高提高1.39%。

研究背景与目的：哈萨克斯坦北部、乌拉尔和西西伯利亚春小麦生产区超过1700万公顷，全部依赖雨养，水分胁迫是籽粒产量的主要非生物限制，叶锈病、秆锈病、Septoria属病害和褐斑病等经常发生；区域平均产量随季节在1.2—1.8 t/ha波动，部分归因于低投入和传统高秆品种。区域育种主要依靠公共项目，采用杂交后改良系谱法选择，产量测试限于高级阶段；育成品种通常需10—12年，另需2—3年登记试验和3—5年种子繁殖，现代基因组或表型组工具采用少，高级阶段多地点试验稀缺，许多已释放品种仍感病、偏高、易倒伏且对投入响应差；欧洲矮秆品种因更适配现代技术而受农户欢迎。DNA分子标记已成为选择目标性状基因型的有价值工具，但区域内春小麦遗传和分子标记研究尚未转化为应用育种实践。尚待解决的问题包括鉴定与欧亚春小麦带适应性和生产力性状相关的遗传标记，如抽穗天数、株高、穗部生产力性状和籽粒产量；GWAS被证明是该目的可靠工具。KASIB于2000年成立，联合15个以上育种和研究项目，交换种质并开展联合多地点试验；到2018年已交换和评价300余份基因型，并选出142份核心种质。前期分析显示Vrn-_A1春/冬型等位基因影响抽穗期和籽粒产量，1BL.1RS易位存在于21.8%材料中，较1B.1B种质增产6.2%，并使秆锈病严重度由27.6%降至6.6%，其他标记影响千粒重（1000-kernel weight, 1000KW）和籽粒产量。本研究目的是开展GWAS，鉴定与适应性和生产力性状相关的遗传区域，并筛选优良高产种质供育种利用。

关键技术方法（不超过250字）：研究人员使用KASIB核心种质142份，包括哈萨克斯坦8个项目59份和俄罗斯9个项目83份，选自2001—2018年KASIB合作者交换的320余份材料，选择依据为63个KASP-SNP标记评估的DNA多样性、地理代表性和农艺表现；2018年在Karabalyk农业试验站繁殖，2019年分发至另3个站点繁殖，2020年起开展重复试验。表型评价在俄罗斯和哈萨克斯坦4个站点于2020—2022年进行，并利用2005—2018年常规KASIB试验进行标记效应验证。基因型分析采用基因分型测序（genotyping-by-sequencing, GBS），经TASSEL v.5.2.40 GBS v2流程进行SNP calling，PLINK 2.0质控，Beagle 5.5进行缺失基因型定相和插补；以连锁不平衡（linkage disequilibrium, LD）修剪后的主成分作为协变量，在R的GAPIT v3中以BLINK（Bayesian-information-and-linkage-disequilibrium-iteratively-nested-key）混合模型开展GWAS，采用1%假发现率（false discovery rate, FDR）阈值控制多重检验。

研究结果：
2.1 研究站点和年份间的籽粒产量与农艺性状（Grain Yield and Agronomic Traits Across the Study Sites and Years）：方差分析显示站点、年份、基因型以及基因型×站点和站点×年份互作对所有性状均有高度显著影响。Omsk环境最有利，平均籽粒产量达478 g/m²，其他站点为178—249 g/m²；三年平均株高88.3 cm，较其他站点高21.8—27.5 cm；每穗粒数35.6，哈萨克斯坦站点为24.1—26.8；千粒重仅略高于北哈萨克斯坦站（40.8 vs. 39.1 g），Karabalyk最低（31.5 g）。年份间农艺性状变异明显，出苗至抽穗38—44天，抽穗至成熟30—40天，生育期70—85天；所有站点和年份合并分析中，抽穗天数与籽粒生产力正相关且高度显著（r = 0.37，p < 0.001），表明较晚熟基因型产量较高。

2.2 GWAS结果（GWAS Results）：初始数据集为21,693个双等位位点，经缺失率>5%、MAF<8%和观测杂合度>10%过滤后，保留12,502个变异用于插补和注释；高质量变异在染色体上偏向远端基因丰富区。23个SNP中21个至少在2个环境中稳定，11个对至少2个性状表现多效性。7个位点在4—6个站点同时显示效应：7B_9702496_G_C最稳定，在6个实例中影响每穗小穗数（+0.36—+0.52个小穗），并在1个实例中影响抽穗天数；1A_12366171_G_A在5个实例中影响成熟期，等位基因缩短生育期；5A_585020739_G_T在5个实例中影响抽穗天数，并在1个实例中影响株高，使抽穗期延长1.3—1.8天、株高增加3.10 cm；1A_539763488_C_T在4个实例中同时正向影响穗粒重、穗重和每穗粒数；1A_13767380_A_G在4个实例中影响株高，使株高降低2.56—4.60 cm；4D_509666790_G_A在4个实例中正向影响穗收获指数，并在1个实例中影响粒宽；6B_682548960_T_C在4个实例中影响千粒重，但该等位基因降低粒重。

2.3 SNP效应可重复性（SNP Effect Reproducibility）：利用2005—2018年常规KASIB试验中10—12个地点的数据对显著SNP进行复制验证。1A_12366171最初在5个环境中影响成熟天数；在更大KASIB数据集中，该SNP与Karabalyk AES 2010年抽穗天数、该地点2017年籽粒产量以及Omsk SAU（2014、2016）和Chelyabinsk ARI（2017）籽粒产量显著相关。1B_15284504与Karabalyk AES 2021年和2020—2022年抽穗天数显著相关，并在同一地点2010年得到确认，还与Omsk SAU 2014年籽粒产量显著相关。5A_585412831和5A_586604587可能连锁同一基因，GWAS中前者与株高和千粒重相关，后者与抽穗至成熟天数相关；复制试验中二者效应表现为2011年Kurgan、Aktobe和Altay的抽穗天数。四个标记的复制验证确认其对相同性状的效应，并显示与其他重要农艺性状的额外关联，提示可用于育种计划。

2.4 优良种质表现（Performance of Superior Germplasm）：研究人员汇总了11个试验中三个成熟组最高产品种的籽粒产量、抽穗天数和千粒重均值，并检测相应基因型中标记的存在情况，包括1A_12366171和1B_15284504（抽穗和籽粒产量）、1A_539763488（穗部生产力）、5A_585412831（抽穗、株高和千粒重）、6B_682548960（千粒重）及7B_9702496（抽穗和每穗小穗数）。1A_539763488存在于中熟和晚熟组所有高产品种中，6B_682548960存在于18个中熟高产品种中的11个。该高产品种可用于针对广泛适应性和籽粒产量改良的杂交计划，标记信息可用于杂交和选择。

讨论总结：3.1 与已报道基因和QTL比较（Comparison of the Obtained GWAS Results with Previously Reported Genes and QTLs）：5A_585020739_G_T同时增加株高和抽穗期，距离Vrn-_A1约4.3 Mb，5A_586604587_G_A距离Vrn-_A1约2.7 Mb，而普通小麦全基因组LD衰减常为2—5 Mb，因此仅将Vrn-_A1视为邻近候选基因。1A_13767380_A_G位于1A短臂，不能用经典Rht-_B1和Rht-_D1解释，PVE达52.4%且在4个环境稳定，可能是与Rht家族无关的新株高位点。1A_539763488_C_T位于1A长臂，与已报道每穗粒数QTL（498—499 Mb）和粒重QTL（Qtgw.acs-1A.3）区域相近，同时对三个穗部生产力组分正向效应，是标记辅助选择优先目标。5A_585412831_A_G表现拮抗多效性，降低株高（效应?6.19 cm，PVE 44.0%）并增加千粒重（效应+1.64 g，PVE 27.1%），有利于选育矮秆大粒材料。5A_585235173_C_T与成熟和抽穗相关，抽穗PVE最高55.4%，MAF为0.106。3A_732470863_C_T与蛋白质和面筋含量相关，蛋白质PVE最高32.0%、效应+0.48—+0.62%，面筋PVE最高33.8%、效应+1.37—+1.39%，在Omsk条件下稳定；其不同于6BS上的Gpc-_B1（NAM-_B1），被描述为独立基因组候选而非已确立独立位点。4B_9957885_T_G也影响蛋白质和面筋含量。7B_9702496_G_C正向影响抽穗和每穗小穗数；5B_601412050_A_G负向影响二者；1B_518180207_G_A正向影响千粒重和粒宽；6B_682550740_G_A正向影响粒周长和粒面积；6B_682548960_T_C位于6BL远端，不同于近着丝粒的TaGW2-6B，PVE最高48.6%且4个环境稳定，与已报道Qtgw.acs-6B.1一致；4D_509666790_G_A与穗收获指数和粒宽相关。3.2 育种实用价值（Practical Value for Breeding）：1A_539763488_C_T可同时改良三个穗部生产力组分，推荐聚合到育种品系；5A_585412831_A_G兼具降株高和增千粒重，适于选育不损产的矮秆品种；5A_585020739_G_T和1A_12366171_G_A控制成熟期，相反效应等位基因可分别服务北部和南部地区；3A_732470863_C_T和4B_9957885_T_G为独立籽粒品质位点，聚合可能产生加性效应；7B_9702496_G_C稳定性突出且MAF=0.377，可纳入常规标记选择。3.3 局限性与未来展望（Limitations and Future Perspectives）：多地点试验仅限4个主站点，部分环境年份性状数据不全，G×E估计仍不完整；年份间强对比提示可能存在未检出的环境特异QTL；142份材料限制小效应位点和稀有等位基因检测，显著SNP的PVE多为10—50%，多基因控制尚未充分解析；GBS为全基因组但密度较低，报道SNP与最近候选基因物理距离仍较大，因果变异和基因未鉴定；品质位点和株高位点需在等基因或近等基因背景中验证；区域育种尚未充分整合现代基因型工具，后续应开发并验证成本有效的标记面板，在独立育种材料中测试，并将标记辅助选择与基因组预测结合。

研究结论翻译：本研究鉴定出一组对哈萨克斯坦北部和西伯利亚春小麦主要农艺、适应性和籽粒品质性状具有稳定且常为多效性效应的SNP标记。最有价值的位点包括1A_539763488_C_T，其同时提高穗粒重、穗重和每穗粒数；5A_585412831_A_G，其结合了降低株高和提高千粒重；以及3A和4B染色体上独立的蛋白质和面筋增强位点。若干物候相关标记定位在春化基因Vrn-_A1附近，而1A上的株高位点似乎位于不同于经典Rht矮秆基因的区域，提示可能存在新的遗传控制。主要标记在十余年KASIB多地点试验中的独立验证确认其效应在年份、环境和育种背景间稳健。从实践角度看，这些结果为区域育种者提供了经过验证的标记辅助选择和基因组选择工具。由于关键位点的有利等位基因已存在于不同成熟组的优良高产品系中，所鉴定种质可直接作为杂交亲本。将多效性生产力位点与品质和物候标记聚合，应能同时改良产量潜力、对短且多变生长季的适应性以及籽粒蛋白质和面筋含量，而物候标记可用于按特定纬度调整生育期长度。未来工作应聚焦于最有希望位点尤其是1A新株高区域的因果基因精细定位和功能表征，并开展结合多个有利等位基因的田间试验以评估其加性和互作效应。将这些验证标记更广泛地整合到常规育种，并结合高通量表型分析和更深入的基因型×环境分析，有望加速释放适应性更好、产量更高的品种，并增强该全球重要区域小麦生产的稳定性。