《International Journal of Molecular Sciences》：Ameliorative Effect of a Chenopodium formosanum-Derived Peptide on Diabetic Wound Healing and Fibroblast Dysfunction
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氧化应激 contributes to fibroblast dysfunction in diabetic wounds. 研究人员评估了一种先前表征的、来源于少孢根霉（Rhizopus oligosporus）发酵萌发台湾藜（Chenopodium for
氧化应激 contributes to fibroblast dysfunction in diabetic wounds. 研究人员评估了一种先前表征的、来源于少孢根霉（Rhizopus oligosporus）发酵萌发台湾藜（Chenopodium formosanum）的甘氨酸丰富肽（glycine-rich peptide, FGP）在雄性糖尿病db/db小鼠及NIH3T3成纤维细胞中的作用。通过创面面积测量和组织学评估，在14天内考察了局部应用FGP（20或100 ppm）的效果；同时，对暴露于100 mM葡萄糖的成纤维细胞评估了其活力、间隙闭合、细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）、I型胶原蛋白表达及修复相关蛋白。第14天时，100 ppm FGP处理组创面收缩率达77.6%，显著高于未处理组（p < 0.05）。在成纤维细胞中，50和100 ppm FGP分别使ROS水平降低约37%和79%，I型胶原蛋白表达增加约80–90%，并使p-p65 NF-κB/p65 NF-κB比值分别降低38%和48%，MMP-9/TIMP-1比值分别降低61%和66%（p < 0.05）。两种浓度均改善了间隙闭合，而血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）表达仅在50 ppm浓度下显著升高。在所测试浓度中，100 ppm表现出最一致的综合活性，被建议作为进一步临床前评估的优先浓度，但仍需进行正式的剂量优化。这些发现支持FGP在糖尿病创面修复中的进一步研究，而组织水平机制及长期结局仍有待确立。
一、研究背景与问题
糖尿病是全球范围内日益严峻的公共卫生问题。据国际糖尿病联合会第11版糖尿病地图集数据，2024年全球20–79岁成年人中约有5.89亿糖尿病患者，预计到2050年这一数字将增至8.53亿。糖尿病足溃疡是糖尿病最严重且复杂的并发症之一，与周围神经病变、外周动脉疾病、组织修复受损及反复损伤密切相关。糖尿病患者一生中发生糖尿病足溃疡的风险估计为19–34%，且即使成功愈合后复发仍十分常见。正常皮肤创面愈合需经历止血、炎症、增殖和重塑等重叠阶段，需要血小板、中性粒细胞、巨噬细胞、角质形成细胞、内皮细胞、成纤维细胞等多种细胞的协调作用。在增殖和重塑阶段，成纤维细胞迁移至创面床，参与肉芽组织形成，合成并重塑细胞外基质，同时产生支持血管生成和组织修复的生长因子。然而在糖尿病状态下，持续高血糖、氧化应激、持续性炎症及细胞反应受损会破坏愈合各阶段间的正常转换，导致再上皮化、血管生成、肉芽组织形成及细胞外基质重塑缺陷。近年来的单细胞研究进一步证实，糖尿病足溃疡中成纤维细胞状态发生显著改变，成纤维细胞功能障碍在糖尿病创面愈合受损中发挥重要作用。此外，表皮屏障破坏和糖尿病相关免疫功能障碍增加了创面微生物感染的易感性，生物膜形成可导致持续或反复感染，进一步加剧慢性糖尿病创面的炎症和氧化微环境。因此，氧化应激和持续性炎症是糖尿病足溃疡有效组织修复中相互关联的障碍。
台湾藜含有多种生物活性成分，具有抗氧化和细胞保护特性。研究人员此前从萌发台湾藜经少孢根霉发酵产物中分离并表征了一种低分子量甘氨酸丰富肽FGP，并证实其具有抗氧化和细胞保护活性，可调节氧化应激相关信号。然而，FGP是否能改善糖尿病创面修复并在高血糖应激下改善成纤维细胞功能障碍，此前尚未被研究。本研究旨在将FGP的既往表征拓展至糖尿病创面愈合领域，评估其在糖尿病db/db小鼠中的局部应用效果，以及在高糖条件下对NIH3T3成纤维细胞活力、迁移相关间隙闭合、细胞内氧化应激、I型胶原蛋白表达及修复相关信号蛋白的影响。
二、研究内容与主要结论
研究结果表明，局部应用FGP与糖尿病db/db小鼠14天观察期内创面收缩率提高相关，组织学定性检查提示FGP处理创面的表皮和肉芽组织排列更有序、胶原染色更明显。在细胞层面，FGP在高糖条件下改善了NIH3T3成纤维细胞活力和迁移相关间隙闭合，降低了细胞内ROS水平，并增加了I型胶原蛋白表达。这些细胞变化伴随p65 NF-κB磷酸化降低和MMP-9/TIMP-1表达比值下降。综合来看，这些发现为FGP的生物活性提供了体内和体外互补证据，但细胞分子变化不能假定为直接介导了小鼠中观察到的创面愈合效果。在所测浓度中，100 ppm表现出最一致的综合活性，建议作为后续临床前剂量优化研究的优先浓度。研究结论指出，FGP可能支持糖尿病创面修复中的若干相关过程，但仍需进一步研究以确立组织水平机制、长期创面愈合结局及基于FGP创面敷料的转化相关性。
三、关键技术方法
研究人员使用了以下主要技术方法：动物模型方面，采用6周龄雄性糖尿病db/db小鼠（C57BLKS/J Iar-+Leprdb/+Leprdb），购自国家实验动物中心，每只小鼠背部以6 mm无菌组织打孔器创建4个全层切除创面，按固定背部位置分配处理。FGP制备方面，将灭菌台湾藜 sprouts接种少孢根霉（10? spores/mL，5% v/w）于35°C生物反应器中发酵4天，经脱脂、离心、硫酸铵沉淀后，使用分子量截留滤器分级为<2、2–10和>10 kDa组分，再经FPLC和Superdex 30尺寸排阻色谱纯化获得FGP。细胞实验方面，使用NIH3T3胚胎小鼠成纤维细胞系（购自台湾生物资源保存及研究中心），采用CCK-8试剂盒检测细胞活力，Ibidi双孔培养插入物评估迁移相关间隙闭合，DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平，免疫荧光染色检测I型胶原蛋白表达，Western blotting检测p-p65 NF-κB/p65 NF-κB、MMP-9/TIMP-1及VEGF蛋白表达。
四、研究结果
4.1 FGP对糖尿病小鼠创面愈合的影响
研究人员在糖尿病db/db小鼠背部创建全层切除创面，比较未处理组、PBS/SCMC载体对照组、20 ppm FGP组和100 ppm FGP组的创面愈合情况。结果显示，L-FGP和H-FGP组在整个实验期间创面收缩率均高于Model组和PBS/SCMC组。第3天时，L-FGP和H-FGP组的创面收缩率分别为33.3%和54.7%，显著高于Model组和PBS/SCMC组。第14天时，H-FGP组创面收缩率达77.6%，显著高于Model组。
4.2 FGP对糖尿病小鼠皮肤组织学的影响
组织学检查显示，第11天所有组均形成新的表皮层。高倍镜下，Model组创面表皮较薄且不规则，肉芽组织排列较差，而FGP处理创面表皮结构更均匀，肉芽组织更致密且排列更有序。第14天时，成纤维细胞样细胞和血管结构在创面组织中更明显，尤其在H-FGP处理组。Masson三色染色在FGP处理组中较Model组和PBS/SCMC组更明显，提示胶原沉积增加。这些组织学观察为定性结果。
4.3 FGP对高糖条件下NIH3T3细胞活力、ROS、迁移相关间隙闭合及I型胶原蛋白表达的影响
与对照组相比，100 mM葡萄糖处理24小时使细胞活力显著降低约20%，该浓度被用作后续实验的高糖条件。FGP单独处理（10、20、50、100 ppm）不显著改变细胞活力。在高糖条件下，20、50和100 ppm FGP共处理显著提高细胞活力。高糖处理使ROS产生显著增加2.6倍，50和100 ppm FGP共处理分别使ROS水平显著降低约37%和79%。高糖组间隙闭合显著减少，50和100 ppm FGP共处理显著增强间隙闭合，而20 ppm未产生显著改善。高糖组I型胶原蛋白表达显著降低，50和100 ppm FGP共处理使I型胶原蛋白表达显著增加约80–90%。
4.4 FGP对高糖培养基中NIH3T3细胞愈合通路的影响
与对照组相比，高糖组p-p65 NF-κB/p65 NF-κB和MMP-9/TIMP-1蛋白表达比值显著升高，VEGF蛋白表达降低。20、50和100 ppm FGP共处理分别使p-p65 NF-κB/p65 NF-κB比值降低约24%、38%和48%，使MMP-9/TIMP-1比值降低约37%、61%和66%。VEGF表达仅在50 ppm FGP组显著高于高糖组。
五、讨论与结论
讨论部分指出，成纤维细胞功能障碍是糖尿病创面修复受损的重要特征。高糖暴露损害了成纤维细胞活力、间隙闭合和I型胶原蛋白表达，而FGP部分改善了这些细胞反应。氧化应激和持续性炎症信号与糖尿病创面功能障碍密切相关，FGP减弱了高糖诱导的ROS增加和p65 NF-κB磷酸化。MMP-9过度活性与糖尿病足溃疡愈合不良相关，FGP降低了MMP-9/TIMP-1蛋白表达比值并伴随I型胶原蛋白表达增加，提示向更有利的细胞外基质调节方向转变。然而，研究人员明确指出多项局限性：未使用夹板固定的背部切除创面模型不能完全复制人类糖尿病足溃疡的病理生理特征，小鼠创面闭合受收缩影响较大，而人类皮肤创面更依赖肉芽组织形成和再上皮化；创面收缩的统计分析未明确考虑同一动物内多次创面和重复测量的相关性；组织学评估为定性；100 mM葡萄糖代表严重细胞应激模型，缺乏渗透压对照；组织水平氧化应激、炎症标志物和Nrf2信号未评估。研究结论为：局部应用FGP与糖尿病db/db小鼠14天观察期内创面收缩率提高相关，组织学定性检查提示FGP处理创面组织排列改善；FGP在高糖条件下降低细胞内ROS水平，改善NIH3T3成纤维细胞活力、迁移和I型胶原蛋白表达，伴随p65 NF-κB磷酸化降低和MMP-9/TIMP-1比值下降。这些发现提示FGP可能支持糖尿病创面修复中的若干相关过程。100 ppm产生最一致的综合反应，可优先用于后续临床前剂量优化研究。但观察到的分子变化应视为相关细胞反应而非确证因果机制的证据，需进一步研究确立组织水平机制、长期创面愈合结局及FGP创面敷料的转化相关性。
