黑胡椒根际 Bacillus velezensis DLB3 的拮抗活性、非生物胁迫耐受性与抗生素敏感性表型及基因组特征解析

《International Journal of Molecular Sciences》：Phenotypic and Genomic Characterization of Bacillus sp. DLB3, a Black Pepper Rhizosphere Isolate with Antagonistic, Abiotic Stress-Tolerant, and Antibiotic-Susceptible Traits

　　

将生物防治活性与环境胁迫耐受性相结合的根际细菌是可持续农业的有价值候选者。本研究通过双培养和纸片扩散拮抗试验、酶与铁载体筛选、生理耐受试验、抗生素敏感性试验、全基因组测序和基因组挖掘，对分离自黑胡椒根际土壤的菌株DLB3进行了表征。系统发育基因组学分析以及平均核苷酸一致性（average nucleotide identity, ANI）>97%和数字DNA–DNA杂交（digital DNA–DNA hybridization, dDDH）>79%值，将该分离株鉴定为 Bacillus velezensis。该菌株抑制 Fusarium falciforme、Fusarium oxysporum 和 Colletotrichum gloeosporioides（径向生长抑制47.6–71.2%），并对 Ralstonia solanacearum 产生8.4 mm的抑制圈，同时产生胞外蛋白酶、淀粉酶、羧甲基纤维素酶（CMCase）和儿茶酚型铁载体。DLB3耐受较宽范围的温度（20–50 °C，最适生长25–40 °C，峰值35 °C）、pH（5–9）和盐度（高达10% NaCl），并表现出对Pb、Zn、Cu和Cr的最低抑制浓度（minimum inhibitory concentrations, MICs）分别为1800、500、450和250 mg L^?1，同时对所测试的九种抗生素均保持敏感。其3,913,361 bp草图基因组组装为44个contig（N50 = 990,239 bp；L50 = 2），根据CheckM完整性为99.81%、污染为0.12%。基因组含有18个生物合成基因簇（biosynthetic gene clusters, BGCs）、碳水化合物活性酶（carbohydrate-active enzymes, CAZymes）、肽酶以及与重金属抗性相关的基因，与观察到的表型大体一致；此外还含有 cfr 甲基转移酶基因同源物（97.4%一致性），但该同源物未在表型上表达。这些发现为菌株DLB3及其生物防治相关潜力提供了全面的基因组和表型图谱。

研究背景：全球人口增长使粮食需求上升，植物病原物和害虫造成全球农业产量约20–40%损失，并影响经济和粮食安全；化肥和化学农药虽提高产量，但过度与不当使用导致土壤退化、环境污染和健康风险。植物根际促生细菌（plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR）如 Bacillus、Pseudomonas、Rhizobium 和 Agrobacterium 被视为可持续替代物。Bacillus velezensis 为革兰阳性、杆状、好氧、产内生孢子的 B. subtilis 物种复合群成员，可产生脂肽（surfactin、iturin、fengycin）和聚酮（macrolactin、bacillaene、difficidin）等抗菌代谢物，分泌水解酶并诱导系统抗性。根际细菌还面临温度、pH、盐度及重金属等非生物胁迫；候选PGPR需评估抗生素敏感性和抗性基因。既往 B. velezensis 表型与基因组研究在生物防治、胁迫耐受和抗生素敏感性整合程度不一。为此，研究人员对黑胡椒根际分离的 Bacillus sp. DLB3 开展整合表型与基因组研究，评估其拮抗活性、生理耐受、抗生素敏感性及潜在遗传决定因素。研究确认DLB3为 B. velezensis，显示其具有拮抗、铁载体与胞外酶产生、较宽非生物胁迫耐受、重金属耐受及抗生素敏感特征，基因组挖掘为其表型提供遗传基础；这些结果为该菌作为多功能生物防治候选及后续功能与田间验证提供了依据。

关键技术方法：菌株DLB3分离自越南Dak Lak省黑胡椒（Piper nigrum L.）根际土壤；F. falciforme 和 F. oxysporum 来自Dak Lak省病黑胡椒根，C. gloeosporioides 来自Lam Dong省病鳄梨叶，R. solanacearum 来自Dong Nai省病番茄根。研究人员采用双培养与纸片扩散法测定拮抗，进行酶与铁载体筛选、温度/pH/盐度及重金属MIC耐受试验，按EUCAST纸片扩散法测抗生素敏感性；全基因组测序后组装、注释及CheckM/QUAST质控；以Roary核心基因、IQ-TREE建树及ANI/dDDH分类；用antiSMASH、dbCAN3、MEROPS、BacMet和CARD进行基因组挖掘。

研究结果：2.1 Morphological Characteristics of Bacillus sp. DLB3：LB琼脂37 °C 24 h菌落乳白、直径1.7–7.0 mm、隆起、边缘不规则、干燥皱褶；革兰阳性杆状，扫描电镜长1.5–2.7 μm、宽0.61–0.92 μm；Schaeffer–Fulton染色见卵形内生孢子，符合 Bacillus 属。2.2 Genome Assembly and Functional Annotation：基因组3,913,361 bp、44个contig、G+C 46.45%、最大contig 1,115,001 bp、N50 990,239 bp、L50 2；CheckM完整性99.81%、污染0.12%；3818个预测基因，含3740 CDS、74 tRNA、3 rRNA；COG以氨基酸转运代谢9.05%、转录8.40%、碳水化合物转运代谢6.61%、无机离子转运代谢6.26%为主，24.98%功能未知。2.3 Phylogenomic and Taxonomic Classification：Roary得17,322基因簇、329核心基因；核心基因最大似然树以100%支持将DLB3归入 B. velezensis 分支；与8株 B. velezensis 的ANI>97%、dDDH>79%，与模式株NRRL B-41580为ANI 97.43%、dDDH 80.2%，超过物种界定阈值，确认其为 B. velezensis。2.4 Antagonistic Activity Against Fungal and Bacterial Pathogens：双培养对 F. falciforme、F. oxysporum、C. gloeosporioides 的径向生长抑制率分别为47.6%、54.1%、71.2%，以 C. gloeosporioides 最高（p<0.001）；对 R. solanacearum 抑菌圈8.4±0.1 mm。2.5 Production of Lytic Enzymes and Catecholate-Type Siderophore：淀粉酶、CMCase、蛋白酶水解圈分别为17.7±0.5、21.2±0.6、15.1±0.4 mm；Arnow法缺铁培养滤液OD₅₁₀=0.966±0.062，对照0.015±0.001，FeCl₃充足时0.039±0.003，缺铁显著高于其他条件（F=693.2，p<0.0001）。2.6 Growth Tolerance Under Stress Conditions：25–40 °C最适，35 °C峰值OD₆₀₀=1.79±0.02，45 °C以上急剧下降，55 °C无生长；pH 5–6最适，pH 10无生长；NaCl至10%可耐受，1–2%最高，12%完全抑制；重金属MIC为Pb 1800、Zn 500、Cu 450、Cr 250 mg L^?1，顺序Pb>Zn>Cu>Cr。2.7 Antimicrobial Susceptibility Profile：按EUCAST九种五类抗生素测试，对美罗培南、亚胺培南、红霉素、克林霉素、利奈唑胺、万古霉素敏感，抑菌圈17.5–38.2 mm；环丙沙星23.7 mm、左氧氟沙星27.6 mm，诺氟沙星筛选25.3 mm>21 mm为screen-negative；九种抗生素均未检出耐药。2.8 Genome Mining Reveals Genetic Determinants Underlying Observed Phenotypes：antiSMASH预测18个BGCs，8个与MIBiG已知簇高相似，包括fengycin、bacillaene、macrolactin H、bacilysin、bacillibactin、bacillothiazol A-N、surfactin和andalusicin A/B，与拮抗及儿茶酚型铁载体活性一致；dbCAN3获113个CAZymes（41 GH、39 GT、13 CE、12 CBM、5 AA、3 PL），33个含信号肽，GH13_28 α-淀粉酶和GH5_2与相应酶活一致，GH18、GH16、GH46、GH23/GH73等与细胞壁降解相关；MEROPS检出73个肽酶位点，包括bacillolysin（95.7%）和subtilisin BPN’（97.8%）；BacMet检出68个金属抗性/稳态基因，铜相关13个（最高96.5%），锌13个（最高51.8%），铬5个（最高61.7%），铅仅 nmtR（45.5%）；CARD Strict标准检出10个抗性基因，多数对应未测抗生素或消毒剂，vanT/vanY仅低一致性（33.7–34.9%）且无完整调控系统，cfr 23S rRNA甲基转移酶同源物 clbA 一致性97.4%但表型仍对克林霉素和利奈唑胺敏感。2.9 Comparative Genomic Analysis：DLB3与9株参考菌泛基因组含6959基因簇，其中核心2486、壳2294、云2179；202个（2.9%）为DLB3独有，多为假定蛋白；APBKEJPL_03128–03151对应83.8-kb杂合NRPS/trans-AT PKS/羊毛硫肽区域，MIBiG无匹配；fengycin、bacillaene、bacilysin、bacillibactin、surfactin在DLB3及多数参考中保守，FZB42的plantazolicin簇在DLB3缺失，andalusicin A/B簇为DLB3区别于9株参考的特征。

讨论与结论：讨论指出，B. subtilis 复合群形态、生化及16S rRNA难以区分，全基因组指标支持DLB3分类；其BGCs与拮抗活性一致，核心与辅助簇反映开放泛基因组，DLB3独有andalusicin A/B及杂合NRPS/PKS/羊毛硫肽区域的功能尚待确定。DLB3对 R. solanacearum 抑菌圈8.4 mm低于FZB42的20.40 mm但处于其他 B. velezensis 报道范围；真菌抑制率高于部分菌株报道，但靶标和条件限制直接比较。温度、pH、盐度耐受与其他根际 B. velezensis 相近；铜、锌、铬抗性基因提供部分遗传基础，铅MIC最高但仅检出中等一致性 nmtR，原文指出铅耐受可能涉及细胞壁和胞外聚合物被动生物吸附/沉淀，实验室结果不宜直接外推土壤。DLB3对九种临床相关抗生素均敏感，支持生物安全前景；CARD多数决定因素不在测试面板，万古霉素同源基因不完整且表型敏感，cfr-like clbA 高一致性同源物需在规模应用前进行转录和功能表征。原文强调基因组挖掘为预测性结果，需靶向功能/表达研究及 in planta、温室或田间验证。研究结论翻译：本研究表征了从黑胡椒根际土壤分离的根际细菌DLB3，并通过系统发育基因组定位和物种界定基因组指数（ANI、dDDH）确认其为 Bacillus velezensis。该菌株对真菌和细菌植物病原体表现拮抗活性，并产生铁载体和胞外酶，对温度、pH和盐度具有广泛生理耐受，对多种重金属具有抗性，且具有有利的抗生素敏感性谱。基因组挖掘鉴定了生物合成基因簇、碳水化合物活性酶、肽酶和金属抗性决定因素，为若干表型性状提供了合理遗传基础。总体而言，这些发现支持菌株DLB3作为具有非生物胁迫耐受性和抗生素敏感安全性特征的多功能生物防治候选菌株的潜力，值得在实际应用前进一步开展功能和田间验证。