《Pharmaceuticals》：Glycyrrhiza Phytochemicals as Candidate Ligands of Skeletal Muscle Metabolic Regulators: An Integrative Reverse-Docking and Replicate Molecular Dynamics Study
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背景/目的：骨骼肌（skeletal muscle, SM）是胰岛素刺激下葡萄糖处置的主要部位，肌肉代谢受损会促进胰岛素抵抗。甘草（Glycyrrhiza）成分值得作为潜在调控因子进行研究，但许多化合物–靶点关系尚未阐明。本研究旨在对涉及八种肌肉代谢调控因子的
背景/目的：骨骼肌（skeletal muscle, SM）是胰岛素刺激下葡萄糖处置的主要部位，肌肉代谢受损会促进胰岛素抵抗。甘草（Glycyrrhiza）成分值得作为潜在调控因子进行研究，但许多化合物–靶点关系尚未阐明。本研究旨在对涉及八种肌肉代谢调控因子的假说进行优先级排序。方法：从838条LOTUS记录中筛选出100个化合物，对八个晶体学受体模型（800对）进行筛选。通过靶内排序和化学分选，优先选出五对进行三种子聚焦对接和各自三次独立的500 ns分子动力学（molecular dynamics, MD）重复模拟（总计7.5 μs）。同时考察原始位点配体位移和接触保留情况，并结合此前选定窗口及共同400–500 ns区间的MM/PBSA估计值进行分析。结果：天然配体重新对接在每个受体上均恢复了2 ?以内的构象；其中六个受体的最高排名构象满足该标准。Shinpterocarpin–PPARδ、semilicoisoflavone B–p38α MAPK和LTS0113182–PPARα在原始位点驻留方面表现最为一致（400–500 ns期间平均对接构象RMSD为0.157–0.359 nm）。LTS0135332–PPARδ表现出更大的位移（0.581 nm）和依赖重复的接触丢失。Kanzonol B–PTP1B在两个重复中发生重定位（平均RMSD为2.489 ± 1.857 nm）。共同窗口MM/PBSA均值范围为?146.0至?76.1 kJ mol?1。对于PTP1B，历史选定窗口均值为?107.7 kJ mol?1，说明区间敏感性而非亲和力排序。结论：分析支持三个相对一致的结合假说、一个混合的PPARδ结果和一个低置信度的PTP1B结果。需要进行结合和靶点特异性功能实验；计算本身并不能确立靶点调控或骨骼肌功效。
一、研究背景与问题
骨骼肌是胰岛素刺激下葡萄糖处置的主要场所，其代谢功能受损与系统性胰岛素抵抗密切相关。骨骼肌的代谢功能依赖于能量感知、底物利用和胰岛素信号通路的协同调控，其中AMPK及其下游转录共激活因子PGC-1α参与氧化代谢，PPARδ调控脂质利用和肌肉适应。天然产物因其多样的化学骨架，为研究骨骼肌代谢调控因子提供了丰富的候选来源。甘草属植物含有黄酮类、异黄酮类、查尔酮类、香豆素类等多种成分，已有实验证据表明甘草查尔酮A和B可促进成肌细胞增殖和分化，但大多数甘草成分与特定靶点之间的关系尚未阐明。现有研究缺乏对甘草植物化学物与多个骨骼肌代谢调控因子之间相互作用的系统评估，因此需要一种能够优先排序化合物–靶点关系假说的计算方法。
二、研究内容与结论
研究人员构建了一个涵盖骨骼肌代谢调控多个层面的靶点面板，包括AMPK、SIRT1、PPARα、PPARδ、PTP1B、GSK3β、p38α MAPK和HDAC6共八个受体。通过反向对接技术，从838条LOTUS记录中筛选出100个化合物，对八个晶体学受体模型进行了800对筛选。基于靶内归一化排序和化学可开发性分选，优先选出五个化合物–靶点配对进行聚焦对接和三重独立的500 ns分子动力学模拟。研究采用重复模拟设计以暴露对初始条件的敏感性，通过原始位点驻留分析、接触保留分析和MM/PBSA端点能量估计对假说进行综合评估。结果表明，PPARδ–shinpterocarpin、p38α MAPK–semilicoisoflavone B和PPARα–LTS0113182三个配对表现出最一致的原始位点驻留；PPARδ–LTS0135332表现为混合结果，存在重复依赖的口袋边缘重排；PTP1B–kanzonol B为低置信度结果，在两个重复中发生物理位移。该研究的重要意义在于提供了可测试的化合物–靶点假说优先级排序，而非确立实验验证的结合或功效。
三、关键技术与方法
研究人员使用了以下主要技术方法：从LOTUS数据库获取甘草属838条化合物记录，经去重和Lipinski过滤保留475个结构，再经分子量、理化性质筛选获得298个合格结构，最终按Bemis–Murcko骨架覆盖策略选出100个化合物组成筛选库。从RCSB蛋白质数据库选取八个配体结合的晶体结构作为受体模型。使用AutoDock Vina 1.1.2进行天然配体重新对接和反向对接，采用靶内z分数和百分位归一化进行共识排序。使用ProLIF 2.2.1生成相互作用指纹。使用GROMACS 2024进行分子动力学模拟，蛋白质采用AMBER99SB-ILDN力场，配体采用GAFF2和AM1-BCC电荷参数化，每个复合物进行三次独立的500 ns生产模拟。使用g_mmpbsa 3.0.14进行MM/PBSA端点能量计算。
四、研究结果
4.1 文库筛选与天然配体构象恢复
去重和Lipinski过滤从838条源记录中保留475个无违规结构。分子量过滤（200–500 Da）保留362个结构，其中298个满足额外理化标准。100个化合物的筛选子集覆盖了全部69个合格Bemis–Murcko骨架。天然配体重新对接在每个受体上均恢复了2 ?以内的构象，最低RMSD范围为0.372至1.320 ?。六个受体的最高排名构象满足该标准。SIRT1和HDAC6的最高排名RMSD分别为8.31和2.19 ?，但第二排名构象满足标准。
4.2 共识筛选与可开发性分选
LTS0135332总体排名第一（平均靶点百分位0.973），semilicoisoflavone B排名第二，shinpterocarpin排名第三。五个Tier A配对仅映射到八个筛选受体中的四个：PPARδ（两个化合物）、PPARα、p38α MAPK和PTP1B。五个原始化合物在平均z分数排名和两种骨架平衡共识方案下均被保留。敏感性分析表明选择对聚合规则不完全不变：中位数百分位排名将LTS0113182排除在前十之外，最大z排名仅保留LTS0135332和semilicoisoflavone B。
4.3 聚焦对接可重复性与结合位点相互作用模式
每个聚焦复合物在三个种子中均返回相同的最高分数，分数范围为0.0 kcal mol?1。最大成对最高构象RMSD为0.017–0.032 ?，低于2 ?。选定分数为PPARδ–LTS0135332的?10.4 kcal mol?1、PPARδ–shinpterocarpin的?10.1、PPARα–LTS0113182的?10.0、p38α MAPK–semilicoisoflavone B的?9.8和PTP1B–kanzonol B的?9.2。
4.4 重复模拟与配体构象行为
在共同400–500 ns分析区间内，PPARδ–shinpterocarpin、p38α MAPK–semilicoisoflavone B和PPARα–LTS0113182显示出最一致的原始位点驻留，系统平均配体RMSD分别为0.157、0.341和0.359 nm。PPARδ–LTS0135332显示0.581 nm的更大位移和重复依赖的接触丢失。PTP1B–kanzonol B在重复1和2中显示物理位移（RMSD分别为3.977和3.082 nm），重复3在最终区间内接近起始位点。
4.5 MM/PBSA端点估计与重复间变异性
在标准化400–500 ns区间内，MM/PBSA估计值为PPARδ–LTS0135332的?146.0 ± 8.9、p38α MAPK–semilicoisoflavone B的?115.9 ± 6.7、PPARδ–shinpterocarpin的?138.4 ± 6.7、PTP1B–kanzonol B的?76.1 ± 20.3和PPARα–LTS0113182的?140.5 ± 11.6 kJ mol?1。PTP1B–kanzonol B在两个窗口方案之间的最大绝对重复水平变化为89.8 kJ mol?1，表明显著的区间敏感性。
4.6 构象采样与补充轨迹描述符
前两个主成分解释了PPARδ–LTS0135332中方差的37.60%、p38α MAPK–semilicoisoflavone B的35.77%、PPARδ–shinpterocarpin的24.49%、PTP1B–kanzonol B的40.75%和PPARα–LTS0113182的50.74%。重复解析的PC1/PC2投影占据重叠但非相同的区域。配体构象聚类识别出占采样结构约三分之一至三分之二的主导群体。
4.7 对接与端点能量估计的跨方法比较
聚焦对接分数与历史选定窗口MM/PBSA估计值之间的关联仅作为描述性五系统比较保留（Spearman ρ = 0.70；精确双侧置换p = 0.233）。由于五个受体–配体系统非等价且经选择，该分析不能确立预测一致性或亲和力排序。
五、讨论与结论
讨论部分指出，重复解析的固定位点分析不支持将全部四个先前优先排序的复合物视为同等稳健。三个配对（PPARδ–shinpterocarpin、p38α MAPK–semilicoisoflavone B和PPARα–LTS0113182）显示最一致的原始位点驻留；PPARδ–LTS0135332保留为混合的低优先级假说；PTP1B–kanzonol B为低置信度、未解决的动态结果。重新处理消除了产生表观9–11 nm配体RMSD的周期性图像伪影，但固定原始位点分析仍显示重复1和2中约3–4 nm的物理位移。研究强调，计算分析评估的是所选力场、质子化状态和起始构象下的行为，不确立实验结合、靶点调控或治疗效果。主要局限性包括缺乏实验验证、采样有限和文库来源问题。结论为：反向对接和重复MD产生了可测试而非实验验证的化合物–靶点假说。固定原始位点再分析支持三个相对一致的驻留假说、一个混合的PPARδ结果和一个低置信度的PTP1B结果。修正后的分析区分了先前的周期性图像伪影与真实位移，并表明仅凭蛋白质稳定性或选定窗口端点能量不足以证明配体驻留。在做出生物学或骨骼肌相关声明之前，必须进行结合和靶点特异性功能实验。
