《Biomolecules》：Lactobacillus crispatus FY121-Derived Extracellular Vesicles Suppress HPV-Positive Cervical Cancer Cells and Activate RIG-I/MAVS/IRF3 Signaling
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高危型人乳头瘤病毒（HPV）感染是宫颈癌（CC）的主要病因，病毒癌基因E6和E7通过促进恶性转化和损害先天免疫应答驱动肿瘤进展。来自有益菌的胞外囊泡（EVs）已成为宿主细胞功能的潜在调节因子，但其在HPV相关宫颈癌中的作用尚不明确。本研究分离并表征了来源于卷曲
高危型人乳头瘤病毒（HPV）感染是宫颈癌（CC）的主要病因，病毒癌基因E6和E7通过促进恶性转化和损害先天免疫应答驱动肿瘤进展。来自有益菌的胞外囊泡（EVs）已成为宿主细胞功能的潜在调节因子，但其在HPV相关宫颈癌中的作用尚不明确。本研究分离并表征了来源于卷曲乳杆菌FY121的胞外囊泡（LcEVs），并研究了它们对HPV阳性宫颈癌细胞系的影响。LcEVs可被HPV16阳性SiHa细胞和HPV18阳性HeLa细胞高效内化，并显著抑制细胞增殖、迁移和侵袭。此外，LcEVs在转录和蛋白水平均降低了HPV E6和E7的表达。机制上，LcEV处理与RIG-I/MAVS/IRF3信号增强以及IFN-β转录和分泌增加相关。转录组学分析进一步揭示了LcEV处理后免疫相关和细胞功能程序的广泛改变。在共注射异种移植模型中，LcEVs减少了HPV阳性宫颈癌细胞的肿瘤建立和早期生长，并伴随肿瘤组织中RIG-I/MAVS/IRF3信号的增强。蛋白质组学分析鉴定了LcEVs内的多种功能性蛋白，为其生物学效应提供了潜在的分子候选物。综上，这些结果表明LcEVs抑制HPV阳性宫颈癌细胞的恶性表型，并在体外和体内伴随核酸传感和I型干扰素信号的激活。活性囊泡货物的身份及其对这些效应的因果贡献仍有待确定，细菌EVs被强调为针对HPV相关恶性肿瘤的候选免疫调节剂。
研究背景与研究目的
宫颈癌是全球女性第四大常见恶性肿瘤，几乎全部病例归因于高危型人乳头瘤病毒（HPV）的持续感染。HPV16和HPV18是最普遍且致癌性最强的基因型，约占宫颈癌病例的70%。HPV编码的E6和E7癌蛋白通过促进细胞失控增殖、血管生成、侵袭转移、端粒酶持续活化以及抵抗凋亡和生长抑制来驱动恶性转化，因此被视为关键的致癌驱动因子和治疗性HPV疫苗开发的主要靶点。尽管预防性HPV疫苗接种、手术、放疗和化疗取得了显著进展，但HPV相关恶性肿瘤的全球负担依然沉重，有效的治疗策略仍有限。
在HPV感染过程中，病毒持续性密切关联于宿主先天免疫感知机制的抑制。研究表明，高危型HPV编码的多种病毒蛋白能够干扰核酸感知通路，包括cGAS-STING介导的DNA感知通路和RIG-I样受体介导的RNA感知通路，从而限制IRF3激活并减少IFN-β产生，促进病毒持续感染和免疫逃逸。因此，在HPV诱导的免疫抑制环境中恢复核酸感知信号和I型干扰素反应，是开发HPV相关恶性肿瘤治疗策略的重要方向。视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体（RLRs）是关键的胞质RNA传感器，能够识别免疫刺激性RNA分子并通过MAVS-TBK1-IRF3信号级联启动I型干扰素反应。利用外源性RNA信号重新激活RIG-I介导的先天免疫反应，可能是一种恢复HPV相关肿瘤免疫功能的有效策略。
胞外囊泡（EVs）由所有生命域的有机体释放，革兰氏阳性乳酸杆菌也能产生膜囊泡。细菌EVs携带来自产生细胞的蛋白质、脂质、核酸和代谢物，作为细菌间和细菌与宿主间通讯的载体。在阴道微生态位中，共生乳酸杆菌释放的EVs与宫颈阴道上皮相互作用并调节宿主细胞反应。值得注意的是，细菌EVs可以将细菌RNA转移到宿主细胞中，囊泡相关RNA被胞质RNA传感器RIG-I识别以诱导I型干扰素反应。然而，阴道乳酸杆菌物种释放的EVs是否调节肿瘤细胞内在的RNA感知，以及这种调节是否影响HPV驱动的宫颈癌进展，在很大程度上仍是未知的。
基于上述背景，本研究旨在探究卷曲乳杆菌FY121来源的胞外囊泡（LcEVs）能否调控HPV相关宫颈癌进展，并阐明其潜在机制。
主要关键技术与方法
研究人员从健康女性阴道分泌物中分离出卷曲乳杆菌FY121（保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号CGMCC No. 28788）。采用超速离心法收集和纯化LcEVs，并通过透射电子显微镜（TEM）观察形态、纳米颗粒追踪分析（NTA）测定粒径分布和浓度、以及四维无标记（4D-LF）蛋白质组学进行蛋白成分鉴定。细胞实验中使用CCK-8法检测细胞增殖，Transwell小室检测细胞迁移和侵袭，实时定量PCR（RT-qPCR）和Western blot检测基因和蛋白表达，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测IFN-β分泌。体内实验采用BALB/c裸鼠皮下共注射模型评估LcEVs对肿瘤建立和早期生长的影响，并使用免疫组织化学（IHC）检测肿瘤组织中相关蛋白表达。此外，还进行了转录组测序（RNA-Seq）和生物信息学分析，以及通过ZDOCK进行的蛋白-蛋白分子对接预测。
研究结果
3.1 卷曲乳杆菌FY121来源LcEVs的表征、功能注释及细胞摄取
通过TEM观察到LcEVs呈球形或椭圆形囊泡结构，平均直径为130.5 nm。NTA测得中位粒径为132.2 nm，制备物浓度为2.5×1011 颗粒/mL。蛋白质组学共鉴定出501种蛋白，亚细胞定位分析显示主要分布在细胞质、细胞膜和细胞壁，符合细菌膜囊泡的特征。功能分类表明这些蛋白主要参与碳水化合物、氨基酸和核苷酸转运与代谢等细胞代谢过程，以及复制、重组、转录和翻译等信息存储与加工过程。荧光标记实验证实，LcEVs可被SiHa和HeLa细胞高效内化。
3.2 LcEVs抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭
CCK-8实验显示，LcEVs以浓度依赖方式降低SiHa和HeLa细胞的活力，在400 μg EV蛋白/mL（对应1×1011 颗粒/mL）浓度下抑制作用最强。Transwell实验表明，LcEV处理显著减少了两种细胞的迁移和侵袭数量。
3.3 LcEVs抑制宫颈癌细胞中HPV16和HPV18 E6/E7癌基因的表达
通过RT-qPCR和Western blot检测发现，LcEV处理显著降低了SiHa细胞中HPV16 E6和E7的mRNA和蛋白表达水平，同样也降低了HeLa细胞中HPV18 E6和E7的mRNA和蛋白表达水平。
3.4 LcEV处理诱导IFN-β表达并激活HPV阳性宫颈癌细胞中的RIG-I/MAVS/IRF3信号轴
LcEV处理显著增加了SiHa和HeLa细胞中IFN-β的mRNA表达和蛋白分泌。同时，RIG-I、MAVS和IRF3的mRNA表达水平升高，Western blot证实RIG-I和MAVS蛋白表达增加，IRF3磷酸化（p-IRF3）水平增强。转录组测序后的基因集富集分析（GSEA）显示，LcEV处理后与免疫调节和细胞功能相关的转录程序发生改变。
3.5 LcEVs在体内抑制肿瘤进展
在SiHa和HeLa细胞分别与LcEVs共注射的裸鼠异种移植模型中，与对照组相比，LcEV处理组的肿瘤体积增长更慢，最终肿瘤重量显著减轻。IHC染色分析显示，LcEV处理组肿瘤组织中RIG-I、MAVS和p-IRF3的表达均增加，阳性细胞比例显著提高。
3.6 LcEV蛋白质组学分析鉴定候选功能蛋白
GO富集分析显示LcEVs中的蛋白主要富集在抗氧化活性等功能类别。硫氧还蛋白（TrxA）被鉴定为具有潜在免疫调节功能的候选蛋白之一。分子对接预测显示，TrxA与RIG-I之间存在相对有利的结合亲和力，并揭示了可能的结合界面和相互作用位点。
讨论与结论
讨论部分指出，LcEVs作为一种潜在的免疫调节剂，可被HPV阳性宫颈癌细胞有效摄取，抑制恶性表型，并降低HPV E6/E7表达。其作用伴随RIG-I/MAVS/IRF3信号轴的激活和IFN-β的产生，这一发现在体内异种移植模型中也得到验证。研究提出，LcEVs可能通过递送外源性RNA配体重新激活该信号通路，从而通过干扰素刺激基因介导的抗增殖效应限制HPV驱动的恶性表型。同时，研究也指出了局限性：尚未明确囊泡RNA是否为直接效应分子，未进行RIG-I或MAVS的功能缺失或获得实验以证明表型效应依赖于该通路，以及候选蛋白如TrxA的作用有待实验验证。
结论部分翻译如下：总之，本研究表明，卷曲乳杆菌FY121来源的胞外囊泡能够降低HPV阳性宫颈癌细胞系的活力、迁移和侵袭能力，并抑制HPV16/18 E6/E7的表达，这些效应伴随着RIG-I/MAVS/IRF3信号轴的激活和IFN-β反应的增强。这些发现将乳酸杆菌来源EVs的生物学意义扩展到超越其在微生物-宿主通讯和免疫稳态中的传统角色，提示LcEVs可能作为天然的免疫刺激性纳米载体，能够调节肿瘤细胞内在的先天免疫感知。负责这些效应的货物以及对RIG-I/MAVS信号的需求在本研究中未被确定，因此本文报告的信号变化应被视为一种关联，为进一步的机制研究提供了基础。
