靶向Toll样受体增强溶瘤病毒疗法：策略与新视角

《Biomolecules》：Targeting Toll-like Receptors to Enhance Oncolytic Virotherapy: Strategies and Emerging Perspectives

　　

：溶瘤病毒疗法（OVT）是一种前景广阔的抗癌策略，其优势在于能够选择性裂解肿瘤细胞并重塑肿瘤微环境（TME）以增强抗肿瘤疗效。尽管新型工程化溶瘤病毒（OVs）在临床试验中不断被引入和研究，但其临床转化仍十分有限，其中Toll样受体（TLR）介导的宿主免疫应答是关键的制约因素。TLRs构成一个结构保守的跨膜蛋白家族，分布于质膜和内体膜上。它们通过识别病原体相关分子模式（PAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs）启动先天免疫应答，对树突状细胞（DCs）成熟至关重要，并在多种肿瘤治疗中发挥关键的调控作用。然而，TLRs也可能限制病毒的复制和扩散，且部分研究表明，在某些条件下它们可能成为肿瘤进展的驱动因素。尽管如此，TLRs在OVT中的作用迄今尚未得到系统总结。在本综述中，研究人员综合了TLRs在OVT中应用的最新进展，重点关注其作用机制和尚待克服的挑战，并探讨其在肿瘤学中的前景，以期为该治疗策略的临床转化提供见解。

论文主体内容总结：

1. 1.
   引言

溶瘤病毒疗法（OVT）是一种新兴的抗癌策略，利用基因修饰或天然存在的病毒在肿瘤细胞内选择性复制并裂解肿瘤细胞，同时基本不损伤正常组织。由此产生的肿瘤限制性溶瘤作用释放肿瘤相关抗原和危险信号，招募并激活宿主抗肿瘤免疫应答。早在20世纪初，临床观察便发现部分癌症患者在病毒感染后出现自发性肿瘤消退，这一现象启发了科学家提出利用病毒治疗肿瘤的构想。然而，由于缺乏有效控制病毒毒力的方法，该领域在此后数十年间进展缓慢。直到20世纪90年代，随着病毒工程技术的进步，研究人员获得了精确修饰病毒基因组的能力，显著提升了溶瘤病毒（OVs）的安全性、靶向性和治疗效力，标志着现代溶瘤病毒疗法研究的转折点。早期OVT研究主要关注病毒固有的复制和裂解能力，并假设适应性免疫系统会清除病毒从而削弱治疗效果。然而，近年来积累的证据表明，免疫系统——特别是抗肿瘤免疫应答——在OV介导的肿瘤清除中发挥着不可或缺的作用。Toll样受体（TLRs）作为先天免疫系统的关键模式识别受体（PRRs），通过其激活机制在OVT中发挥核心作用。OV感染并裂解肿瘤细胞后，病毒核酸等病原体相关分子模式（PAMPs）以及高迁移率族蛋白B1（HMGB1）或热休克蛋白70（HSP70）等损伤相关分子模式（DAMPs）被释放并被TLRs识别，启动下游信号级联，驱动促炎细胞因子和I型干扰素（IFN-I）的产生。然而，TLR激活是一把双刃剑：一方面增强抗原呈递并激活和招募T细胞等效应细胞，建立有效的抗肿瘤免疫；另一方面，过度的IFN-I应答可能过早清除病毒，限制其在肿瘤微环境（TME）中的复制和扩散，最终削弱直接溶瘤效果。此外，研究表明在某些情况下TLR信号可能反常地促进肿瘤进展，进一步增加了治疗策略的复杂性。因此，精确利用TLR激活的双重特性对于优化OVT至关重要，但连接这两个领域的转化研究仍然有限，多个关键的机制和治疗问题尚未解决。

1. 2.
   溶瘤病毒的特性

OVT主要利用野生型或基因工程病毒，其设计目标是特异性靶向肿瘤细胞，利用肿瘤细胞中异常的基因表达或信号通路缺陷实现选择性复制，从而通过直接裂解和刺激宿主抗肿瘤免疫应答实现肿瘤细胞杀伤。代表性策略涉及修饰病毒基因产物对宿主细胞周期的调控作用。例如，通过基因工程从腺病毒（AdV）E1A蛋白中删除与视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）结合所必需的CR2结构域，可阻止被感染的正常细胞进入S期，从而破坏病毒复制所需的细胞内环境，确保工程化病毒仅在能够独立于E1A-Rb相互作用增殖的肿瘤细胞中复制。值得注意的是，某些源自非人类宿主的病毒，如水疱性口炎病毒（VSV）和新城疫病毒（NDV），也可作为有效的抗肿瘤治疗剂。这些病毒的一个关键优势在于人类群体通常缺乏针对它们的高水平预存中和抗体，在一定程度上避免了抗体介导的快速清除，结合其在肿瘤细胞中选择性复制的能力，可能维持TME内的免疫刺激。然而，作为非人类病毒，其在人类中的长期安全性、传播至非靶物种的潜在风险以及病毒突变或环境释放相关的生物安全危害仍需通过严格的临床试验评估。病毒基因组是OVT的核心，但不同病毒科的工程逻辑并不统一。每个病毒科通过根本不同的机制复制，因此具有不同的优势、局限性和工程杠杆。除了基于Baltimore分类的mRNA合成差异外，病毒在复制位点、基因组大小和包装容量方面也存在差异：小型RNA类OVs强烈限制转基因插入，而大型DNA病毒可容纳更复杂的表达盒。基因组整合同样具有家族依赖性：逆转录病毒和慢病毒载体可以整合，而目前临床使用的溶瘤病毒不依赖基因组整合，因此插入突变并非共同的设计关注点。相应地，肿瘤选择性复制必须以家族特异性的方式工程化——例如，靶向AdV中的E1B/Rb–p53轴、删除单纯疱疹病毒（HSV）中的ICP34.5/ICP47、减毒痘苗病毒（VACV）中的胸苷激酶（TK）和痘苗病毒生长因子（VGF），或利用NDV和VSV中IFN-I信号缺陷——这使得溶瘤病毒工程成为对选择性复制、细胞裂解和免疫激活的家族特异性优化。所有成熟病毒颗粒至少包含蛋白质外壳（衣壳）和内部核酸基因组，共同构成核衣壳。衣壳保护核酸免受外部物理和化学因素的降解。部分病毒还拥有包裹核衣壳的包膜，通常源自宿主细胞膜并嵌入病毒编码的糖蛋白（刺突），这些糖蛋白特异性识别并结合宿主细胞表面受体，介导病毒进入。

1. 3.
   溶瘤病毒感染肿瘤细胞

OV感染肿瘤细胞始于病毒表面蛋白与特定细胞受体的结合。尽管某些进入受体在部分肿瘤中上调，但OV选择性主要由缺陷的IFN-I/抗病毒信号、肿瘤响应性工程启动子、缺失或减毒的病毒基因以及肿瘤限制性复制决定，受体丰度仅是其中一个促成因素。例如，CD46分子在多种肿瘤中上调，是麻疹病毒（MV）疫苗株和B种AdV血清型的关键识别受体，桥粒芯蛋白-2（DSG2）是后者额外的蛋白进入受体。柯萨奇病毒A21（CVA21）优先利用衰变加速因子（DAF）和细胞间黏附分子1（ICAM-1），两者均在肿瘤细胞表面高表达。此外，AdV依赖整合素共受体介导内吞；HSV首先通过硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPGs）附着，随后通过糖蛋白D（gD）与进入受体结合触发膜融合。受体结合诱导病毒蛋白构象变化从而介导进入。包膜病毒主要通过膜融合进入细胞，该过程可发生在质膜或内体膜上；无包膜病毒通常通过内吞进入，随后在内体中发生衣壳重组并通过膜结构穿透释放病毒基因组。大多数RNA病毒（如CVA21）在细胞质中复制，而大多数DNA病毒（如AdV）——除VACV外——在核区室中复制。OV在肿瘤细胞内进行大量复制，通过资源耗竭、空间竞争和裂解蛋白表达等机制诱导细胞损伤和免疫原性细胞死亡（ICD）。然而，仅依赖野生型病毒的内在复制能力往往不足以实现完全肿瘤根除和充分的靶向安全性。为此，研究人员采用基因工程策略增强疗效：一方面插入促凋亡基因（如P53、BNIP3）直接增强凋亡通路；另一方面引入自杀基因系统（如胸苷激酶），使被感染细胞能将无毒前药局部转化为细胞毒性化合物，从而放大裂解效应。肿瘤细胞裂解释放两类关键的免疫刺激信号：内源性DAMPs从受损细胞释放，如钙网蛋白（CRT）、HMGB1、HSP70和ATP；PAMPs在病毒复制过程中产生，包括病毒核酸和衣壳蛋白。这些分子共同作用于逆转TME的免疫抑制状态。

1. 4.
   TLR信号及其与其他模式识别通路的交叉

TLRs是I型跨膜蛋白，广泛表达于树突状细胞（DCs）、巨噬细胞和其他白细胞亚群以及肿瘤细胞、基质细胞和内皮细胞的质膜或内体膜上。其结构包含三个结构域：富含亮氨酸重复序列（LRRs）的胞外结构域负责识别危险信号；跨膜结构域锚定受体；胞内Toll/白介素-1受体（TIR）结构域介导下游信号通路激活。目前已在人类和小鼠中分别鉴定出10种和12种TLRs，其中TLR1至TLR9在两个物种间高度保守。TLR3、TLR7、TLR8和TLR9定位于内体膜，主要识别源自OVs或肿瘤细胞本身的核酸成分。TLR3识别双链RNA（dsRNA）及其合成类似物聚肌苷酸-聚胞苷酸（poly(I:C)）；病毒基因组复制过程中产生的dsRNA可结合并激活TLR3。TLR7和TLR8主要识别病毒单链RNA（ssRNA），也可识别受损肿瘤细胞释放的自体RNA。TLR7结合游离鸟苷和ssRNA，而TLR8以高亲和力结合游离尿苷和ssRNA。值得注意的是，啮齿类动物（如小鼠、大鼠）中的TLR8不能被人类特异性配体激活，这一局限性制约了小鼠模型在TLR8相关药物开发中的效用。TLR9识别病毒基因组中富集的未甲基化5′-胞苷-磷酸-鸟苷-3′（CpG）基序以及合成CpG寡脱氧核苷酸（CpG ODNs）。此外，肿瘤细胞释放的自体DNA也可作为TLR9的配体。位于质膜上的跨膜TLRs包括TLR1、TLR2、TLR4和TLR6，主要识别脂质和蛋白质成分。TLR2可与TLR1或TLR6形成异二聚体，分别选择性识别三酰化脂肽和二酰化脂肽。TLR2还可识别多种病毒的包膜蛋白以及宿主来源的DAMPs。例如，HSV糖蛋白B（gB）激活细胞表面TLR2，通过髓样分化初级反应蛋白88（MyD88）和TNF受体相关因子6（TRAF6）依赖性通路触发先天免疫信号，最终导致NF-κB激活。巨细胞病毒（CMV）糖蛋白gB和gH在病毒进入过程中与细胞表面TLR2/TLR1异二聚体直接相互作用，启动最终导致NF-κB激活和炎症细胞因子分泌的信号级联。野生型MV的H蛋白结合TLR2并激活先天免疫应答，但近期研究表明该识别机制可能不适用于减毒MV疫苗株。此外，受损肿瘤细胞释放的自体蛋白和危险信号（如热休克蛋白，HSPs）也可能激活TLR2。TLR4主要识别细菌脂多糖（LPS）。LPS与脂多糖结合蛋白（LBP）结合后，在CD14辅助下被转移至细胞表面，与TLR4-髓样分化因子2（MD-2）复合物相互作用激活下游信号。从坏死细胞释放的核蛋白HMGB1也可作为内源性配体结合TLR4并诱导NF-κB依赖性转录。值得注意的是，HMGB1激活TLR4的分子机制似乎因HMGB1的氧化还原状态和辅助因子的存在而显著不同。HSPs可结合TLR4激活免疫应答，但部分研究表明HSPs和TLR4也可能有助于慢性炎症的维持并促进肿瘤细胞存活。HSP70/TLR4轴被认为可通过招募免疫抑制细胞建立免疫抑制性TME，可能拮抗抗PD-1治疗旨在激活的T细胞应答，导致治疗失败和意外疾病进展。此外，应激肿瘤细胞产生的S100蛋白家族（如S100A8和S100A9）已被确定为重要的内源性TLR4配体，能够激活并放大炎症信号和免疫细胞招募。TLR4通过含TIR结构域的衔接分子诱导IFN-β（TRIF）信号激活干扰素调节因子3（IRF3），诱导IFN-I产生。在TME中，丰富的DAMPs和PAMPs与抗原呈递细胞或肿瘤细胞表面的TLRs结合，通过TLRs的TIR结构域招募衔接蛋白启动信号转导。膜结合型TLR2和TLR4首先与含TIR结构域的衔接蛋白（TIRAP）相互作用并招募MyD88，随后通过白介素-1受体相关激酶（IRAKs）激活下游TRAF6；该级联激活IKK–IκB通路使NF-κB核转位，同时触发MAPK通路（如p38和JNK），最终促进TNF-α、IL-6、IL-1β和CXCL8/CXCL10等促炎细胞因子和趋化因子的转录和释放。值得注意的是，TLR4不仅限于质膜，部分TLR4被内化至内体，信号衔接分子切换为含TIR结构域的衔接分子诱导IFN-β（TRAM）和TRIF，启动另一条下游通路：一条分支通过TRAF3激活IRF3/7驱动IFN-I产生，另一条分支通过TRAF6激活相对温和的晚期NF-κB/MAPK通路诱导细胞因子产生。此外，内体TLR7和TLR9仍依赖MyD88，主要通过快速早期通路激活上述信号，诱导炎症和共刺激分子表达。TLR3通常被认为是唯一不依赖MyD88而完全依赖TRIF的TLR；该通路激活主要磷酸化IRF3并促进其核转位，强烈诱导IFN-I产生，也可通过TRAF6通路激活NF-κB，但产生的促炎细胞因子输出通常低于MyD88依赖性受体。尽管TLR3经典地通过TRIF信号传导而不依赖MyD88，但一项在小鼠骨髓来源巨噬细胞中的研究表明，MyD88在poly(I:C)刺激后部分促成TLR3驱动的NF-κB激活以及IL-6和IFN-β的诱导，该效应弱于TRIF缺失的影响且并非所有细胞类型共有。这些发现与MyD88在TLR3信号中受限的调节性而非普遍性作用一致，并需在其他细胞类型中进一步确认。尽管TLRs在OVT介导的抗病毒和抗肿瘤免疫讨论中占据核心位置，但它们仅是庞大模式识别通路网络中的一个分支。对于活跃复制的OVs，TLRs受限于亚细胞定位，难以直接感知细胞质中产生的大量病毒和肿瘤来源配体。例如，NDV、VSV、呼肠孤病毒（RV）、MV和CVA21在细胞质中复制并产生dsRNA，由RIG-I样受体（RLR）家族识别。具体而言，维甲酸诱导基因I（RIG-I）主要识别带有5′-三磷酸基团（5′-ppp）的短RNA分子，而黑色素瘤分化相关基因5（MDA5）识别长dsRNA。这些受体通过线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）传递信号。尽管HSV和AdV的基因组复制发生在细胞核内，复制中间体和病毒基因组DNA通过核膜泄漏使胞质dsDNA暴露于环状GMP-AMP合酶（cGAS）。cGAS以序列无关方式识别胞质dsDNA，催化第二信使cGAMP的合成并激活干扰素基因刺激因子（STING），从而激活IRF3驱动IFN-I产生以及NF-κB诱导促炎细胞因子和趋化因子。近期研究已确定cGAS-STING与RLR通路之间的交叉对话，揭示许多RNA病毒感染导致线粒体DNA等自体DNA泄漏至细胞质，从而激活cGAS-STING。三种主要的IFN-I衔接蛋白——TRIF、MAVS和STING——最终汇聚于TBK1-IRF3轴。病毒可能利用这些通路间的汇聚节点，通过单一蛋白酶同时阻断多条通路。例如，塞内卡谷病毒（SVV，一种溶瘤病毒）编码的3C蛋白酶可切割宿主免疫信号通路中的多个关键节点，包括TRIF、MAVS和TANK，从而系统性抑制IFN-I产生以实现免疫逃逸。由于这些通路共享关键下游分子，实验设计必须区分所观察效应贡献的具体通路。此外，MyD88不仅是TLRs的衔接蛋白，也是IL-1R和IL-18R的关键信号分子。VSV在小鼠B16黑色素瘤模型中的研究表明，MyD88缺失导致溶瘤效力丧失，证明MyD88是VSV介导溶瘤作用必需宿主因子；但这些研究无法将效力归因于任何特定TLR或上游IL-1R受体。值得注意的是，TLR信号驱动的NF-κB激活还可为炎症小体提供关键的启动信号，上调AIM2/NLRP3炎症小体相关分子的表达，从而许可Caspase-1的激活以及IL-1β和IL-18的成熟。此外，蛋白激酶R（PKR）是另一种由双链RNA激活的激酶，通过磷酸化eIF2α抑制翻译起始来增强细胞抗病毒状态。与TLR通路不同，PKR主要作为胞质dsRNA传感器发挥作用，其抗病毒效应基本独立于TLRs。

1. 5.
   将TLR信号与溶瘤病毒疗法相联系的策略

TLR信号在OVT中占据双重地位。一方面，TLR激活连接先天免疫和适应性免疫，驱动DCs成熟、自然杀伤（NK）细胞激活和CD8⁺ T细胞启动，将TME转化为"热"表型。另一方面，过度或慢性TLR激活可触发过早病毒清除、招募免疫抑制性髓系群体，并在某些情况下维持恶性进展。这种张力使TLRs既是治疗靶点又是风险因素。研究人员围绕五个基于机制的TLR中心干预类别重新组织了该领域：内源性TLRs对OVs的自然感知；使用非复制病毒或病毒颗粒作为TLR激动剂；将OVs与外源性TLR激动剂联合；工程化OVs以增强TLR信号；以及有意抑制TLR信号以增强病毒复制。

5.1 内源性TLRs对OVs的自然感知

当OVs有效感染肿瘤时，PAMPs和DAMPs被肿瘤、基质、内皮和免疫细胞上表达的内源性TLRs感知，启动抗肿瘤免疫应答的先天分支。其后果具有高度细胞类型特异性：正常乳腺组织干细胞保留完整的IFN-I应答抵抗病毒感染，而乳腺癌起始细胞具有缺陷的IFN-I和TLR信号，以TLR9/MyD88转运受损和TLR2缺失为特征，使其对衣壳修饰的腺病毒Ad5/3-Delta24易感。作为关键哨兵细胞，DCs处于该感知的中心。常规DCs（cDCs）通过NF-κB和MAPK通路检测危险信号后成熟，释放TNF-α和IL-12并启动T细胞共刺激，而浆细胞样DCs（pDCs）在TLR7/9刺激下分泌大量IFN-I。这种区分在功能上具有决定性：当肿瘤细胞进行头对头比较时，仅MV感染的细胞而非紫外线照射的细胞诱导pDC成熟和强效IFN-α产生。机制上，在pDCs中，溶瘤麻疹由RIG-I样受体和TLR7识别，这种pDC限制性感知组合许可这些细胞表达TNF相关凋亡诱导配体（TRAIL）并通过TRAIL–DR5（死亡受体5）结合杀伤。由此产生的IFN-I连同DC来源的IL-12促进NK细胞的激活和扩增。在IFN-I预刺激阶段，NK细胞对低或无MHC-I靶标表现出增强的细胞毒性，通过颗粒酶B和穿孔素裂解它们并分泌IFN-γ和TNF-α，从而建立放大抗肿瘤免疫的正反馈环路。至关重要的是，这种先天感知本身并非终点：其最终读出是持久适应性免疫的启动。除趋化因子介导的CD8⁺ T细胞招募外，成熟DCs摄取外源性肿瘤抗原，经溶酶体加工后将衍生肽段呈递于MHC-II上，启动初始CD4⁺ T细胞向Th1效应细胞分化。通过交叉呈递，DCs还将外源性抗原装载于MHC-I上，并在Th1来源细胞因子支持下将初始CD8⁺ T细胞启动为细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）。两条证据说明了这一接力：暴露于H-1细小病毒诱导的肿瘤细胞裂解物的DCs上调TLR3/TLR9以及CD86等成熟标志物和NF-κB/TNF-α，这一表型与增强的交叉启动一致。与此互补，吞噬MV感染肿瘤细胞的pDCs已被证明可将NY-ESO-1交叉呈递给特异性CD8⁺ T细胞克隆，确认OV感染细胞可许可DC介导的CD8⁺应答。

5.2 使用灭活病毒或病毒颗粒作为TLR激动剂

与依赖瘤内病毒复制和直接溶瘤的策略不同，部分研究仅利用OVs的特定结构成分或灭活的复制缺陷病毒颗粒作为免疫治疗剂。尽管这些制剂无法表达病毒基因，但完全保留了病毒来源的PAMPs，因此可作为天然TLR配体激活先天和适应性免疫，从而发挥抗肿瘤效应同时避免复制相关毒性。关于TLR2轴，研究表明紫外线灭活的HSV-1（UV-HSV-1）可在暴露一小时内快速增强外周血单个核细胞（PBMCs）和纯化NK细胞对白血病细胞的细胞毒性。该过程涉及CD69上调、脱颗粒和IFN-γ分泌，伴随糖酵解等代谢重编程。值得注意的是，使用TLR2中和抗体可显著拮抗这种细胞毒性增强。类似地，紫外线灭活的HSV-2已被证明通过TLR2依赖性NF-κB通路刺激NK细胞，促进IFN-γ释放并增强抗肿瘤活性，与抗NKG2A/抗HLA-E检查点抗体联合时该效应可进一步增强。在TLR3轴背景下，RV及其紫外线灭活形式（UV-RV）被发现可使胃癌患者的PBMCs和CD8⁺肿瘤浸润淋巴细胞敏感化。两种细胞类型均被证明通过TLR3/NF-κB通路上调IFN-γ和TRAIL。此外，RV σC蛋白可结合肿瘤细胞相关TLR3，通过p38/p53通路上调DR4/DR5，从而增强效应细胞对胃癌细胞的杀伤。另外，用RV来源dsRNA转染卵巢癌细胞被发现通过上调TLR3并激活TRIF下游的TBK1/IRF3和NF-κB诱导凋亡；该凋亡可通过使用TLR3抑制剂或TBK1/IKKε抑制剂逆转。此外，尽管豇豆花叶病毒（CPMV）不能在细胞内复制或发挥直接溶瘤效应，但它可能作为原位疫苗发挥作用：其空病毒衣壳激活TLR2/4，而完整病毒粒子额外结合TLR7，从而诱导IFN-I产生并可能引发更强的免疫治疗效果。总体而言，使用灭活病毒或病毒颗粒作为TLR激动剂在安全性和免疫激活效力之间取得平衡，可与免疫检查点抑制剂（ICIs）、化疗等治疗联合，为其作为癌症免疫治疗"复制无能"佐剂的应用奠定基础。

5.3 将OVs与外源性TLR激动剂联合

尽管OVs暴露肿瘤抗原，但单独使用OVs可能无法逆转免疫抑制性TME。由此积累的调节性T细胞（Tregs）、髓源性抑制细胞（MDSCs）和M2巨噬细胞阻止有效抗原呈递并导致T细胞激活不足。TLR激动剂可提供强效的补充危险信号，促进IFN-I和促炎细胞因子分泌，驱动M2巨噬细胞向抗肿瘤M1巨噬细胞再极化，进一步增强T细胞免疫应答。例如，将TLR3配体poly(I:C)与HSV-1联合治疗葡萄膜黑色素瘤可重新激活被病毒下调的TLR3–NF-κB轴，促进M1极化从而增强抗肿瘤免疫。类似地，将TLR9配体CpG ODN（与蜂毒肽自组装为CpGMel复合物以增强递送）与柯萨奇病毒B3联合治疗三阴性乳腺癌和黑色素瘤，利用ICD激活抗原呈递和T细胞应答，抑制原发肿瘤并延缓远处转移。然而，联合策略也可能产生不利结果。虽然使用TLR9配体（CpG ODN）与表达膜锚定IL-2的修饰痘苗病毒（vvDD-mIL2）联合的"原位疫苗"方法成功清除了注射肿瘤、延长生存期并诱导远隔效应且具有良好安全性——通过增加效应T细胞、NK细胞和DCs浸润动态重塑未治疗部位的TME——但它也触发了Tregs、MDSCs和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的代偿性上调。因此，需要髓系细胞清除或抗PD-1治疗以进一步放大疗效。此外，虽然TLR4配体LPS与VSVs的序贯瘤内给药治愈了100%的荷瘤小鼠，但切换为静脉注射VSV后给予LPS则导致以TNF-α和IL-6激增为特征的致死性细胞因子风暴。这为全身给药相关的狭窄治疗窗口提供了严峻警示。

5.4 工程化OV以增强TLR信号

与外源性给药TLR激动剂的策略不同，基因工程方法涉及将TLR激动剂分子或其编码序列直接插入病毒基因组，使OV在肿瘤内复制的同时原位持续释放激动剂信号。通过富集TLR识别序列的策略，一项研究将18个免疫刺激性CpG基序插入AdV基因组构建了CpG富集病毒Ad5D24-CpG，显著增强TLR9识别和NF-κB激活，在完全保留亲本病毒安全性的同时提高免疫原性。该病毒通过TLR9通路减弱MDSCs的免疫抑制功能并增加瘤内CD8⁺ T细胞浸润，该效应已通过TLR9敲除寡核苷酸确认为TLR9依赖性。另一策略涉及工程化病毒表达内源性TLR激动剂。例如，一种AdV被工程化表达人β-防御素-2（BD2），一种被TLR4识别的内源性危险信号。在病毒裂解肿瘤细胞并释放抗原的同时，BD2招募并促进pDCs成熟，诱导肿瘤特异性CD4⁺/CD8⁺ T细胞和IFN-γ应答，产生针对再攻击的完全保护性免疫并抑制自然转移。类似地，工程化MV表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白（NAP）——一种TLR2激动剂样脂蛋白——在以低PD-L1表达和低T细胞浸润为特征的免疫学"冷"滑膜肉瘤中导致中性粒细胞的大量招募和激活，将"冷"肿瘤转化为"热"肿瘤并上调PD-L1，为与ICIs联合治疗创造了有利条件。除引入激动剂元件外，另一种增强方法是移除病毒自身的先天免疫拮抗基因。一项研究提出构建一种感染后激活TLR3–IRF3通路的VACV。通过逐步移除拮抗该通路的病毒基因（C10L、N2L和C6L），肿瘤细胞内IRF3磷酸化和IFN-β表达得以恢复，转化为小鼠模型中更强的肿瘤抗原特异性T细胞应答和治疗获益。

5.5 抑制TLR信号以调节抗病毒应答

TLR激活后的信号级联最终建立了限制病毒复制和加速病毒清除的关键屏障。基于这一原理，研究试图通过抑制或减弱TLR识别来增强病毒复制和递送效率。在肿瘤细胞水平，TLR3在结肠上皮中组成性表达。敲低TLR3显著减少宿主IFN-I触发，从而增强RV在肿瘤内的复制，伴随病毒σ1蛋白的显著上调和与对照相比显著增强的病毒介导肿瘤生长抑制。在病毒工程方面，VACV表面蛋白的去糖基化可减弱其与TLR2的结合及随后的MyD88信号激活，减少抗病毒中和抗体的产生，从而增强静脉给药后病毒向肿瘤的全身递送并保留重复给药能力。在递送载体方面，使用TLR4或MyD88沉默的间充质干细胞（MSCs）作为AdV载体可在全身给药后减少全身炎症，改善载体向肿瘤的归巢和递送效率，从而增强抗肿瘤疗效。然而，TLR9敲低小鼠的研究揭示TLR9信号也参与NK细胞向肿瘤的招募，是抗肿瘤免疫的促成因素。因此，TLR通路的激活或抑制呈现明显的"双刃剑"效应。理想策略需要在增强病毒复制和维持抗肿瘤免疫之间取得平衡，并针对特定病毒类型、肿瘤类型、给药途径和免疫微环境进行定制。

1. 6.
   TLR靶向溶瘤病毒疗法的临床转化

尽管上述证据大多为临床前研究，但多个OV平台和TLR靶向免疫调节剂已进入临床，其积累的经验对于评估以TLR为中心的OVT的转化潜力至关重要。

6.1 溶瘤病毒的临床转化

OVs的临床格局已从首类单药获批成熟为广泛的平台特异性和联合策略，日益将病毒溶瘤与免疫检查点阻断相结合。在已批准产品中，talimogene laherparepvec（T-VEC，Imlygic），一种粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）武装的HSV-1，于2015年获FDA批准用于不可切除黑色素瘤的病灶内治疗。最近，2026年8月，FDA授予vusolimogene oderparepvec（TUDRIQEV，原RP1）加速批准，这是一种表达GALV融合糖蛋白和GM-CSF的双工程化HSV-1，与nivolumab联合用于既往抗PD-1治疗进展的晚期皮肤黑色素瘤。跨平台而言，单药活性仍然有限且主要局限于局部控制，而临床意义的应答集中于瘤内递送武装或工程化病毒，最常与检查点阻断联合。HSV-1平台体现了这一模式：RP1加nivolumab在抗PD-1难治性黑色素瘤中客观缓解率（ORR）为32.9%，T-VEC加pembrolizumab在PD-1难治性晚期黑色素瘤中ORR达19.7%，在肉瘤中为30%，尽管确证性III期T-VEC-pembrolizumab试验在PD-1初治黑色素瘤中未达主要终点。可比信号超越HSV-1：柯萨奇病毒V937加pembrolizumab在晚期黑色素瘤中ORR达47%，DNX-2401加pembrolizumab在复发性胶质母细胞瘤中临床获益率为56.2%。相反，递送方式匹配不佳或患者选择不当则效果不足——最明显的是静脉注射V937，与pembrolizumab联合未显示附加获益，以及肝内T-VEC，在肝肿瘤队列中始终产生低缓解率。将OVT与持久和系统性获益联系起来的机制原理是将免疫学"冷"肿瘤转化为"热"肿瘤，临床数据与此模型基本一致：当溶瘤作用经瘤内递送并与检查点阻断配对时获益最大，且V937联合ipilimumab以及RP1-nivolumab已记录到远处非注射病灶的消退。OVT总体耐受良好，不良事件（AEs）主要为注射部位反应（ISRs）和短暂低级别流感样症状，治疗相关≥3级事件保持较低水平（T-VEC加pembrolizumab为12.7%；RP1加nivolumab为12.9%），表明全身安全性余量良好。相比之下，疗效主要由疾病背景和既往治疗暴露而非耐受性决定：在两项试验中，缓解率在辅助治疗背景下复发患者（T-VEC加pembrolizumab ORR 40–47%；RP1加nivolumab为50%）与转移背景下进展患者（T-VEC加pembrolizumab ORR 0–6.7%）之间急剧分化。

6.2 TLR靶向免疫调节剂的临床转化

TLR激动剂的单药活性通常有限。在一项口服TLR7激动剂前药RO7119929的I期研究中，一名肝细胞癌患者获得持久完全缓解，但总体临床活性仍然有限。相比之下，已获FDA批准的TLR7激动剂imiquimod显示出更一致的效用，长期用于癌前宫颈病变，且新辅助imiquimod在早期口腔癌中似乎安全且有前景。当前大多数开发因此集中于联合方案。TLR激动剂常与nivolumab、pembrolizumab或ipilimumab等ICI配对，并根据肿瘤类型与靶向药物或化疗联合。卡介苗（BCG）激活TLR2、TLR4和TLR9通路，体现了类似模式：尽管它仍是膀胱癌免疫治疗的基石，但最佳疗效通常需要与其他药物联合。然而，多项II/III期试验结果令人失望。在抗PD-1难治性晚期黑色素瘤中，将瘤内tilsotolimod（一种TLR9激动剂）加入ipilimumab并未显著改善ORR、无进展生存期（PFS）或总生存期（OS），且该策略增加了毒性，包括更高的≥3级AE发生率和新的严重过敏反应信号。类似地，在复发性卵巢癌中，将TLR8激动剂motolimod加入聚乙二醇化脂质体多柔比星并未改善OS、PFS或缓解率，尽管确认了免疫激活。值得注意的是，出现注射部位反应的motolimod治疗患者死亡风险显著降低且OS长于未出现者。全身给药进一步受限于剂量限制性毒性（DLT），特别是细胞因子释放综合征（CRS）。口服RO7119929以剂量依赖性方式在81%患者中诱导CRS，任何级别治疗相关AE发生率为91%。静脉注射GSK1795091与94%患者的治疗相关AE相关，静脉注射pixatimod在所有治疗患者中均引起AE。常见AE包括发热、寒战、疲劳和恶心，与流感样或免疫激活症状一致。相比之下，TLR3激动剂rintatolimod在静脉给药后相对耐受良好，未报告DLTs。局部给药联合放疗产生了最具机制说服力的结果，特别是通过诱导远隔效应。在复发/难治性惰性非霍奇金淋巴瘤患者中，瘤内SD-101（一种TLR9激动剂）联合低剂量放疗和ibrutinib治疗在大多数患者中诱导远处未治疗肿瘤的消退，中位PFS为11个月。类似地，在低剂量放疗后，瘤内注射G100（一种TLR4激动剂）在滤泡性淋巴瘤20 mg剂量队列的18名可评估患者中13名导致远隔消退。这些发现将TLR激动剂定位为"原位接种"策略的候选组成部分，其中局部先天免疫激活产生系统性抗原特异性适应性免疫。这一原理也支持探索TLR调节作为基于OVs的免疫治疗的一部分，其中局部先天免疫刺激可能同样有助于将免疫学"冷"TME转化为更允许抗肿瘤T细胞应答的状态。

1. 7.
   讨论

讨论综合当前证据以提供具体的转化指导，解决决定OVT中基于TLR调节临床可行性的三个关键问题：针对特定病毒平台应靶向或抑制哪些受体、在何种背景下这种操作有益而非有害、以及如何有效平衡抗病毒和抗肿瘤免疫应答。首先，最具可操作性的TLR激动剂的选择取决于OV的基因组类型和复制区室，因为这些特征决定了哪些配体在何处积累。通过TRIF信号传导的内体TLR3是产生dsRNA的RNA OVs——如RV、VSV、NDV和MV——最具药理学可及性的靶点之一，使poly(I:C)及相关TLR3激动剂在机制上与这些平台兼容，尽管RIG-I/MDA5和TLR7/8也可能参与RNA感知。DNA OVs（HSV、AdV和VACV）呈现未甲基化CpG基序并释放复制来源DNA，从而涉及TLR9和胞质DNA传感器，特别是cGAS–STING轴，因此CpG ODN和STING导向辅助剂代表机制上合理的配对。表面表达的TLR2和TLR4主要感知病毒包膜糖蛋白和DAMPs（例如HSV gB、MV H、HMGB1、HSP70和S100A8/9），最适合局部使用或与灭活/颗粒制剂配合，而非作为生产性复制的一般驱动因素。内体TLR7和TLR8感知ssRNA，是RNA平台的相关靶点，特别是在预期全身递送或内体暴露时；然而，全身细胞因子释放的风险应缓和从临床前到临床的推断。其次，决定治疗获益的主要是TLR调节的时间和解剖背景，而非其方向本身。抑制抗病毒臂——如TLR3沉默以允许RV复制、VACV去糖基化以减弱TLR2结合、以及TLR4/MyD88沉默的MSC载体用于AdV——可增强病毒扩散和溶瘤。该策略在早期复制和传播窗口最有价值，特别是在IFN-能力或高度浸润的肿瘤中，过早病毒清除可能限制治疗。然而，同一干预在全身应用或后期阶段可能有害，因为TLR9信号也支持NK细胞招募和DC交叉启动，不加区分地抑制可能损害支撑持久OVT疗效的适应性臂。实用规则因此是在抗原生成时应用短暂局部抑制以保护病毒，并在抗原释放后倾向于TLR激动以维持DC许可。第三，抗病毒和抗肿瘤免疫可通过在空间和时间上分离这两个阶段来调和，而非优先考虑其一。如上所示，途径和顺序具有决定性，全身OVs联合TLR刺激存在致死性TNF-α/IL-6细胞因子风暴风险，强调了瘤内给药优于全身给药的安全性优势。在此狭窄窗口内，将TLR驱动的先天激活与OV诱导的ICD和髓系再极化配对可能有助于将短暂炎症转化为持久CTL应答，同时限制全身毒性。该框架可能有助于解释TLR激动剂在临床中有限的单药活性，但仍在很大程度上处于临床前阶段，需要前瞻性