近红外光响应脂质体调控可切换CAR-T细胞治疗间皮素阳性卵巢癌的研究

《International Journal of Nanomedicine》：Near-Infrared Light-Responsive Liposomes for Modulating Switchable CAR-T Cell Therapy

　　

嵌合抗原受体T（chimeric antigen receptor T，CAR-T）细胞疗法具有巨大潜力，但受脱靶效应和细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）的限制。为应对这些挑战，研究人员开发了一种间皮素（mesothelin）靶向的可切换CAR-T细胞系统，其活性可通过近红外（near-infrared，NIR）光响应脂质体进行外部控制。研究人员通过慢病毒转导构建了间皮素靶向的可切换CAR-T细胞，并制备了NIR响应脂质体制剂，包封小分子切换剂（雷帕霉素或AP21967），以实现NIR照射下的受控释放。通过包封NIR触发型光敏剂，脂质体变为光不稳定型，暴露于730 nm光可诱导脂质过氧化，从而允许药物释放。将可切换CAR-T细胞与表达间皮素的卵巢癌细胞（OVCAR-3）在不同条件下共培养，有或无NIR照射。通过乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）释放实验评估细胞毒性，并通过酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测量细胞因子分泌（肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2））。可切换CAR-T细胞在缺乏诱导剂时表现出极低的基线细胞毒性。NIR照射后，脂质体释放包封的切换剂，以浓度依赖性方式激活CAR-T细胞。NIR触发的激活显著增强了TNF-α和IL-2的分泌，并在体外增强了对间皮素阳性卵巢癌细胞的杀伤效果。研究结果表明，可切换CAR-T技术与NIR响应脂质体的结合可实现CAR-T活化的时空控制，为减轻脱靶毒性提供了一种潜在策略，并促进CAR-T疗法在实体瘤中的临床应用。

近红外光响应脂质体调控可切换CAR-T细胞治疗卵巢癌的研究解读

一、研究背景与科学问题

卵巢癌是全球女性第八大常见癌症，2020年约占新发病例的3.7%和癌症死亡病例的4.7%。据国际癌症研究机构（IARC）统计，2022年全球卵巢癌新发病例达32.4万例，死亡20.6万例。目前卵巢癌治疗仍以手术切除、放疗、化疗和靶向治疗为主，但55%–75%经一线治疗获得缓解的患者在2年内复发，5年生存率低于40%。嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法在体外和临床试验中展现出良好的细胞毒活性和持久性，为细胞免疫治疗提供了新方案，但面临脱靶效应和细胞因子风暴两大挑战。高水平的CAR-T细胞扩增和短期靶细胞杀伤可导致细胞因子风暴，严重时可致高热、低血压甚至多器官衰竭；同时，多数CAR-T细胞靶向的肿瘤相关抗原也表达于非肿瘤组织，导致on-target off-tumor效应。为应对上述问题，现有研究策略包括调节CAR亲和力、设计逻辑门控CAR和自杀基因调控开关等。Wendell Lim团队创新设计了可切换CAR（switchable CAR），这种CAR-T细胞默认处于关闭状态，由两部分组成：胞外抗原结合域（单链可变区片段，scFv）和下游关键信号元件（免疫受体酪氨酸激活基序，ITAM，源自T细胞受体CD3ζ亚基）。可切换CAR包含可异源二聚化的结构域，在结合异源二聚化小分子（雷帕霉素或AP21967）时相互作用，从而激活T细胞。这种设计允许通过小分子剂量精确控制CAR-T活性，有效减轻副作用，但实体瘤治疗中CAR-T细胞的分布靶向仍存在问题。纳米技术的发展为癌症治疗提供了新手段，脂质体等纳米载体可通过增强渗透滞留（EPR）效应在实体瘤中蓄积。光作为外源性刺激具有微创性和高时空远程可控性等优势，近红外（NIR）光（700–1000 nm）穿透更深、散射更低、对皮肤和正常组织损伤最小，是优选光源。因此，本研究旨在构建间皮素靶向的可切换CAR-T细胞，并结合NIR响应脂质体实现光控的CAR-T激活，以解决脱靶效应和实体瘤靶向效率低的问题。

二、研究内容与结论

研究人员首先构建了间皮素靶向的传统CAR-T细胞（mesoCAR-T）和可切换CAR-T细胞（OCT），并制备了负载雷帕霉素或AP21967的NIR响应脂质体（LPR/LPA）。体外实验表明，mesoCAR-T细胞对间皮素高表达的OVCAR-3细胞具有特异性杀伤作用，杀伤效率随效靶比和反应时间增加而提高。可切换CAR-T细胞在无小分子诱导剂时基线细胞毒性极低，在雷帕霉素或AP21967存在时以浓度依赖性方式激活，200 nM浓度下12小时可杀伤约80%靶细胞。NIR响应脂质体粒径约141.7 nm，包封率达98.43%，在4°C储存7天和血清环境中保持稳定。NIR照射下，光敏剂PdPC(OBu)₈产生单线态氧（¹O₂），氧化DLPC的不饱和碳碳双键，破坏脂质膜结构，实现药物响应性释放。体内实验采用SK-OV-3卵巢癌小鼠模型，证实NIR照射可调控可切换CAR-T细胞的抗肿瘤活性。该研究的意义在于实现了CAR-T活化的时空控制，为减轻脱靶毒性和细胞因子风暴提供了潜在策略，为CAR-T疗法在实体瘤中的应用奠定了基础。

三、主要关键技术方法

本研究采用的主要关键技术方法包括：通过慢病毒转导构建间皮素靶向的可切换CAR-T细胞，采用流式细胞术和Western blot验证CAR基因和蛋白表达；采用薄膜分散法制备NIR响应脂质体，通过动态光散射检测粒径和Zeta电位，高效液相色谱测定包封率和载药量；利用DPBF探针检测单线态氧产生，紫外分光光度法验证DLPC结构变化；体外细胞毒性通过乳酸脱氢酶（LDH）释放实验评估，细胞因子分泌水平通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测；体内抗肿瘤实验使用SK-OV-3卵巢癌细胞皮下接种NSG雌性小鼠模型。外周血单个核细胞（PBMC）购自Sailybio公司。

四、研究结果

mesoCAR-T细胞对OVCAR-3肿瘤细胞的杀伤效应： 通过PCR扩增和酶切重组成功构建mesoCAR基因，流式细胞术显示CAR表面表达率超过70%。ELISA检测显示mesoCAR-T细胞的TNF-α分泌量（698.2 ± 68.2）显著高于未转染T细胞（240.1 ± 108.7），IL-2分泌量（401.4 ± 8.1）也显著升高。LDH释放实验表明，mesoCAR-T细胞对间皮素高表达OVCAR-3细胞的杀伤效率显著高于间皮素低表达HO8910细胞，且杀伤效率随效靶比增加和时间延长而增强，效靶比10:1时24小时可完全裂解靶细胞。

可切换CAR-T细胞对OVCAR-3肿瘤细胞的杀伤效应： 可切换CAR基因设计为A、B两个片段，A片段包含pCCL载体骨架、SS1-CD8TM和4–1BB-FKBP，B片段包含pCCL载体骨架、DAP10-CD8TM-FRB和CD3ζ，并插入mCherry基因用于荧光观察。流式细胞术显示可切换CAR表达效率超过90%，Western blot检测到61 kDa的外源CD3ζ融合蛋白。细胞毒性实验表明，可切换CAR-T细胞对靶细胞的杀伤以雷帕霉素和AP21967浓度依赖性方式增强，200 nM浓度下12小时杀伤约80%靶细胞。高浓度药物组TNF-α和IL-2分泌水平显著升高。

光响应脂质体的表征： 采用薄膜分散法制备负载PdPC(OBu)₈和雷帕霉素的光响应脂质体（LPR），粒径141.7 ± 1.5 nm，PDI值0.036 ± 0.001，Zeta电位?12.8 ± 0.6 mV，雷帕霉素包封率98.43 ± 0.47%，载药量1.15 ± 0.01%。脂质体在4°C储存7天粒径和PDI保持稳定，在20%乙醇和血清中48小时结构完整。DPBF荧光实验证实NIR照射下光敏剂持续产生¹O₂，紫外吸收实验表明¹O₂氧化DLPC不饱和双键产生共轭二烯，破坏脂质膜稳定性。

NIR触发雷帕霉素调控可切换CAR-T细胞杀伤OVCAR-3细胞： 不同强度NIR照射（0–1200 mW/cm2）下可切换CAR-T细胞和OVCAR-3细胞存活率均高于90%，不同浓度脂质体共孵育后细胞存活率也高于90%，表明光和脂质体毒性较低。LPR+CAR-T细胞经NIR照射后对OVCAR-3细胞的杀伤效率显著高于未照射组和未转染T细胞组，且对间皮素高表达OVCAR-3细胞的杀伤效果优于低表达HO8910细胞。负载雷帕霉素的LPR和负载AP21967的LPA在相同摩尔浓度下对可切换CAR-T细胞的调控效果无显著差异。

NIR调控CAR-T细胞体内抗肿瘤活性： 由于OVCAR-3细胞未能在小鼠体内成瘤，选用表达间皮素的SK-OV-3细胞建立皮下瘤模型。与对照组相比，mesoCAR-T细胞表现出较缓慢的肿瘤生长曲线和较低的肿瘤重量。未接受NIR照射的可切换CAR-T细胞抗肿瘤活性与PBS组无显著差异，而NIR照射后表现出显著差异，证实NIR可调控可切换CAR-T细胞的体内抗肿瘤活性。

五、讨论与结论

本研究成功制备了靶向间皮素高表达卵巢癌的LPR+CAR-T细胞。关于雷帕霉素的免疫抑制特性，研究表明非免疫抑制剂量（如体内0.01 mg/kg，谷浓度约1.5 ng/mL）的雷帕霉素可有效驱动DARIC介导的T细胞激活，且AP21967等非免疫抑制雷帕霉素类似物可在无免疫抑制的情况下实现等效激活。NIR响应脂质体在体外表现出良好的药物释放特性，但体内生物分布和肿瘤蓄积仍有待优化，EPR效应在不同肿瘤类型间存在异质性。未来可通过PEG化优化延长循环半衰期，或偶联抗间皮素抗体片段等主动靶向配体增强肿瘤特异性蓄积。研究存在以下局限性：体外机制实验使用OVCAR-3细胞，而体内实验因OVCAR-3细胞成瘤困难改用SK-OV-3细胞，且SK-OV-3细胞间皮素表达水平相对较低，观察到的体内肿瘤抑制可能包含靶依赖和非靶依赖成分；研究未纳入3D球体模型模拟肿瘤微环境的物理屏障和致密纤维化结构；雷帕霉素对T细胞功能的潜在影响仍需进一步阐明。未来研究应纳入3D球体模型和/或使用靶抗原高表达肿瘤细胞的体内实体瘤模型，以更严格评估靶特异性治疗效力和肿瘤微环境穿透能力。总之，研究人员成功制备了靶向间皮素高表达卵巢癌的LPR+CAR-T细胞，体外实验证实其具有光敏释放特性和NIR刺激下的靶向清除效果，为CAR-T疗法在卵巢癌等实体瘤治疗中的应用提供了数据支持。