负载miR-302c-3p的阳离子TAmP/PCEC水凝胶：靶向ADAMTS5抑制与骨关节炎治疗

《International Journal of Nanomedicine》：MiR-302c-3p-Encapsulated Cationic TAmP PCEC Hydrogels for Targeted ADAMTS5 Suppression and Osteoarthritis Treatment

　　

引言 骨关节炎（osteoarthritis, OA）仍是一种退行性关节疾病，治疗选择有限。方法 研究人员检测了miR-302c-3p在人OA软骨和原代软骨细胞（primary chondrocytes）中的表达，验证ADAMTS5（aggrecanase-2）为其直接靶点，并开发了一种PCEC/TAmP水凝胶用于去稳定内侧半月板（destabilization of the medial meniscus, DMM）小鼠模型中的关节腔内递送。结果 miR-302c-3p在OA软骨中下调，并通过降低ADAMTS5、基质金属蛋白酶1（matrix metalloproteinase 1, MMP1）和基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13, MMP13）表达而保留Ⅱ型胶原（type II collagen, COL II），从而减轻白介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）诱导的软骨细胞分解代谢。PCEC/TAmP水凝胶实现了miR-302c-3p的持续释放并改善其软骨穿透性，增强了其在OA小鼠中的治疗效果。结论 负载miR-302c-3p的PCEC/TAmP水凝胶可能是用于靶向治疗OA的一种有前景的关节腔内策略。

骨关节炎（osteoarthritis, OA）是常见的退行性关节炎，可导致老年人疼痛和身体功能障碍；遗传易感、营养供应不足、创伤和下肢力线异常等因素均参与其发生，炎性细胞因子通过促进软骨降解在发病中起重要作用。ADAMTS5（aggrecanase-2）与OA细胞外基质（extracellular matrix, ECM）及软骨退变密切相关，被视为潜在治疗靶点，但现有认识仍不完整。微小RNA（microRNA, miRNA）可结合靶信使RNA的3′非翻译区（3′ untranslated region, 3′UTR）负调控基因表达，并参与OA不同分子通路；miR-214-3p、miR-140、miR-26b-5p等已被研究。研究人员通过miRNA测序发现miR-302c-3p在正常与OA原代软骨细胞间差异表达，靶点预测提示ADAMTS5可能为其下游靶点，但miR-302c-3p是否直接靶向ADAMTS5、该调控轴能否整合入先进关节腔内递送系统尚待阐明。现有透明质酸（hyaluronic acid, HA）和糖皮质激素关节腔注射存在递送效率低、清除快、需反复注射等问题；核酸治疗还受软骨糖胺聚糖（glycosaminoglycan, GAG）负电排斥和滑液周转限制。聚乙二醇-聚ε-己内酯共聚物（poly(ethylene glycol)-poly(ε-caprolactone) copolymers, PCEC）水凝胶具生物相容性，但核酸稳定性与穿透仍受限；阳离子聚合物可静电结合核酸、增强稳定性和软骨穿透，却易被滑膜快速清除。因此，研究人员构建阳离子叔胺修饰五嵌段纳米颗粒（cationic tertiary amine-modified pentablock nanoparticles, TAmP），与PCEC水凝胶结合，用于miR-302c-3p的关节腔内递送，并在IL-1β诱导软骨细胞退变和DMM小鼠模型中验证疗效。研究得出miR-302c-3p在OA软骨中下调、可直接靶向ADAMTS5并减轻软骨细胞分解代谢；PCEC/TAmP水凝胶可缓释miR-302c-3p、改善软骨穿透并增强其治疗效能，为靶向ADAMTS5的OA治疗提供了递送策略。

关键技术方法（不超过250字）：人OA软骨取自全膝关节置换患者（n=5，60–68岁），正常软骨取自无关节炎病史、因股骨颈骨折行全髋关节置换患者（n=5，66–71岁）；采用原代人软骨细胞、SW1353细胞和雄性C57BL/6小鼠DMM模型。主要方法包括荧光原位杂交、qRT-PCR、Western blot、双荧光素酶报告基因、免疫组化及组织学评分；合成TAmP并制备PCEC/TAmP水凝胶；进行透射电镜、扫描电镜、流变学、粒径与zeta电位分析；Transwell缓释、CCK-8、器官H&E；软骨外植体穿透、体内荧光成像及关节腔内注射。

研究结果：
1. miR-302c-3p在OA软骨中下调，并通过直接靶向ADAMTS5抑制IL-1β诱导的软骨细胞分解代谢。荧光原位杂交显示miR-302c-3p在正常关节软骨中易检测、在OA软骨中显著减少，阳性细胞比例显著降低。原代软骨细胞转染miR-302c-3p mimics后，IL-1β诱导的MMP1、MMP3、MMP13、ADAMTS4、ADAMTS5表达受抑，部分恢复COL II；Western blot显示miR-302c-3p过表达降低ADAMTS5、MMP1、MMP13并保留COL II。双荧光素酶报告显示miR-302c-3p mimics降低野生型ADAMTS5 3′UTR报告活性，对突变型无明显影响。SN50、SB203580或PD98059预处理减弱IL-1β诱导的ADAMTS5上调和miR-302c-3p下调，提示NF-κB和MAPK信号参与该轴调控。

2. PCEC/TAmP水凝胶用于治疗剂递送的药理与物理性能。TAmP由五嵌段前体PCL₁₀-b-P(CL-Br)₁₀-b-PEG₍₄₀₀₀₎-b-P(CL-Br)₁₀-b-PCL₁₀经带叔胺基团硫醇亲核取代合成；TEM显示负染阳离子TAmP颗粒，其zeta电位约17.3±0.9 mV。琼脂糖凝胶电泳显示N/P比为8:1时游离miRNA条带完全消失，故后续采用8:1。PCEC与TAmP混合形成可流动白色液体，静置过夜成胶；SEM显示冻干水凝胶呈多孔三维网络。TAmP/miR-302c-3p复合物平均粒径约73.1 nm（PdI=0.591），zeta电位0.409±0.290 mV。流变学显示水凝胶具剪切变稀行为，储能模量G′高于损耗模量G″；载miR水凝胶G′和G″高于无miR水凝胶；30–40℃保持凝胶特性，37℃附近储能模量略降但仍为凝胶态；水凝胶可塑形、通过细针注射，37℃下红蓝水凝胶接触界面24小时渐变混合。

3. PCEC/TAmP水凝胶特征：阳离子囊泡形成、miR-302c-3p持续释放及良好生物相容性。Transwell释放实验中，水凝胶释放物含平均粒径约110 nm的囊泡（PdI=0.504）；累积释放约32天达平台，每日释放持续约30天，而PBS@Cy5-miR-302c-3p组4天内释放完毕。CCK-8显示SW1353细胞与水凝胶培养无显著细胞毒性；DMM诱导OA小鼠和正常小鼠关节腔内注射后，心、肝、脾、肺、肾未见功能损害。

4. 通过PCEC/TAmP水凝胶递送miR-302c-3p更持久、稳定且更易穿透。软骨外植体实验中，水凝胶组在1天或3天后显示更深穿透和软骨表面Cy5-miR-302c-3p明显富集，利于软骨细胞摄取。小鼠关节腔注射体内成像显示，对照组荧光第7天完全减弱，水凝胶组持续14–21天。OA模型小鼠治疗后原位杂交显示，OA关节miR-302c-3p显著低于sham；水凝胶递送恢复miR-302c-3p表达，关节软骨表面呈强而特异富集，治疗效果最明显，甚至超过sham生理水平。

5. PCEC/TAmP水凝胶介导的miR-302c-3p递送减轻小鼠OA进展。DMM模型治疗6周后，Safranin O/fast green和H&E染色显示miR-302c-3p治疗组软骨结构更完整、炎性损伤减少，水凝胶组最明显；OARSI评分在内侧股骨髁和内侧胫骨平台证实水凝胶增强miR-302c-3p疗效。免疫组化显示miR-302c-3p增加COL II表达，水凝胶递送进一步放大该效应；miR-302c-3p降低MMP13表达，水凝胶组进一步显著降低，提示持续释放带来更优抗炎和软骨保护作用。

讨论部分总结：ADAMTS5因降解聚集蛋白聚糖而在OA研究中长期受关注；miRNA对OA软骨具有合成与分解双重作用。本研究显示miR-302c-3p在OA软骨下调，过表达可降低ADAMTS5、MMP1、MMP13并保留COL II；双荧光素酶证实其直接靶向ADAMTS5 3′UTR；NF-κB和MAPK通路参与IL-1β对该轴的调控。miRNA临床应用受关节微环境中快速降解失活限制，PCEC水凝胶因载药和控释特性受关注。TAmP呈中央亲水PEG链、两端阳离子基团及外部疏水PCL段的结构，静电结合负电miRNA并在生理条件下可逆释放；其合成经CL溴化、微波辅助开环聚合及叔胺硫醇亲核取代，五嵌段结构增强自组装稳定。水凝胶使miR-302c-3p释放延长至32天，且合成条件温和，保留PCEC生物降解性和生物相容性；阳离子聚合物增强软骨基质穿透，水凝胶增加miR-302c-3p穿透深度。细胞和动物实验未见TAmP显著细胞毒性或器官毒性；流变学证实其可注射和融合渗透。作者同时指出OA为多因素疾病，miR-302c-3p是关节调控网络的一部分；局限包括缺乏不同阳离子水凝胶对照、体内生物降解数据不足、体内疗效未设单独水凝胶对照以完全区分载体独立贡献，以及未在所有治疗动物样本直接评估ADAMTS5表达，仍需后续验证。

研究结论（翻译）：总之，本研究表明miR-302c-3p在人OA软骨中下调，并减轻IL-1β诱导的软骨细胞分解代谢。机制上，miR-302c-3p通过靶向其3′UTR直接抑制ADAMTS5，从而有助于维持软骨基质稳态。此外，IL-1β相关的MAPK和NF-κB信号通路似乎参与miR-302c-3p/ADAMTS5轴的调控。此外，PCEC/TAmP水凝胶提供miR-302c-3p的持续释放并改善其软骨穿透，这可能有助于其在OA中的治疗效能。这些发现支持负载miR-302c-3p的PCEC/TAmP水凝胶作为靶向OA治疗的有前景且具临床转化潜力的策略。