《Molecules》：Three New Secondary Metabolites from Colletotrichum boninense, an Endophytic Fungus in Polygonum multiflorum
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与药用植物相关的内生真菌构成了结构多样且具有生物活性的天然产物的有前景来源。在本研究中，研究人员调查了从药用植物何首乌（*Polygonum multiflorum* Thunb.）中分离的内生真菌刺盘孢菌（*Colletotrichum boninense*
与药用植物相关的内生真菌构成了结构多样且具有生物活性的天然产物的有前景来源。在本研究中，研究人员调查了从药用植物何首乌（*Polygonum multiflorum* Thunb.）中分离的内生真菌刺盘孢菌（*Colletotrichum boninense*，菌株H10）的次级代谢产物。从基于稻米的发酵培养物中共分离出25种次级代谢产物，其中三种为新化合物：一种麦角甾类化合物（m1）和两种solanapyrone型聚酮类化合物（m2和m3）。通过综合波谱学分析（包括1D/2D NMR、HRESIMS、ECD计算和X射线晶体学）阐明了这些化合物的结构。已知化合物包括甾体、聚酮、生物碱和脂肪酸。基于ITS和LSU序列的系统发育分析显示，*Colletotrichum boninense*及相关刺盘孢菌菌株在小丛壳菌科（Glomerellaceae）内形成一个 distinct 分支。这些新的solanapyrone和甾醇衍生物支持该类化合物在刺盘孢菌属物种中的化学分类学意义。本研究丰富了源自何首乌的内生真菌的化学多样性。
内生真菌定殖于健康植物组织、器官和细胞间隙，并在宿主植物的几乎整个生命周期中持续存在而不引起任何疾病症状。内生真菌在产生生物活性天然产物方面发挥着重要作用，可被视为对农业化工和制药工业具有可观经济潜力的战略性生物资源。内生真菌广泛分布于植物界，已有超过160万种内生真菌物种从植物宿主中被报道。前期研究表明，内生真菌在植物生长过程中常发挥抗微生物、抗氧化和抗虫活性，并与宿主形成协同共生关系。
何首乌（*Polygonum multiflorum* Thunb.）是中药何首乌（Polygoni Multiflori Radix）的基原植物，收载于《中国药典》（2025年版）第一部。现有对何首乌的研究多集中于栽培、加工炮制、化学成分和药理活性方面，而对栖居于何首乌的内生真菌次级代谢产物的研究仍相对有限。从何首乌植株中分离的内生真菌类型和数量均有限，筛选出的活性菌株也较少，因此需要进一步探索。前期研究表明，生长在温暖潮湿地区的植物拥有更丰富的内生真菌群落。本研究的何首乌样品采集自中国西南部温暖潮湿的贵州省，该地区的气候有利于该药用植物相关内生真菌的高多样性。
刺盘孢菌属（*Colletotrichum*）真菌是侵染谷类、豆类和水果等多种植物的破坏性采后病原菌。然而，许多刺盘孢菌物种可以在无症状植物组织内以内生菌方式生存。单一菌株能够根据宿主生理状态和环境条件在内生与致病生活方式之间切换。刺盘孢菌属属于半知菌亚门黑盘孢目中的一个分支。据报道，这些真菌产生的代谢物显示出多种生物活性。迄今为止，至少已有109种次级代谢产物从炭疽菌中被报道，包括含氮代谢物、甾醇、萜类、吡喃酮、酚类和脂肪酸，其中以含氮化合物为主。尽管从刺盘孢菌中获得的萜类化合物总数仍然相对较少，但新发现正在迅速增加，目前已列出若干单萜、倍半萜和二萜。在筛选新型抗糖化剂的过程中，从源自*Sabicea cinerea*的内生真菌胶孢刺盘孢菌（*Colletotrichum gloeosporioides*）中发现了四种新的acorane型倍半萜以及七种已知化合物。其结构通过质谱（MS）和核磁共振（NMR）波谱学阐明，绝对构型则通过圆二色（CD）分析确定。
为了探索与何首乌相关的内生真菌的多样性和次级代谢产物资源，研究人员使用内转录间隔区（ITS）和大亚基（LSU）序列构建了系统发育分析数据集。在从何首乌分离的内生真菌菌株中，菌株H10被鉴定为与*Colletotrichum boninense*具有100%序列相似性。鉴于该真菌此前研究较少，研究人员选择菌株H10进行其次级代谢产物研究。经过发酵、代谢物分离、纯化和结构表征，其次级代谢产物以甾体、脂肪酸、聚酮和生物碱为主，其中鉴定出三种新化合物。这项工作初步阐明了何首乌内生真菌的次级代谢产物化学特征，扩展了天然药用资源，并为进一步开发何首乌内生真菌作为天然产物的新来源提供了理论依据和实践指导。
在系统发育分析中，用于鉴定何首乌内生真菌的各比对序列长度分别为ITS 634 bp和LSU 891 bp。将ITS和LSU序列的联合数据集用于系统发育分析。获得的序列提交至NCBI GenBank数据库，并使用BLAST搜索与参考序列进行比较。物种鉴定的核苷酸相似性阈值设定在97%至100%之间。在分离得到的16株内生真菌菌株中，三株菌株（H4、H10、H16）与其各自的参考菌株显示出100%的序列相似性，可在物种水平上进行鉴定。菌株H4被鉴定为*Colletotrichum crassipes*（100%相似性），H10为*C. boninense*（100%），H16为*Colletotrichum destructivum*（100%）。其余菌株与最接近匹配物的相似性值在99.0%至99.98%之间，但由于匹配缺乏独特性，仅鉴定到属水平。系统发育分析显示，分离的内生真菌属于五个不同的科：Pleosporineae、Glomerellaceae、Diaporthaceae、Ceratostomataceae和Nectriaceae。这些科进一步分布于六个属：*Phaeosphaeria*、*Colletotrichum*、*Alternaria*、*Diaporthe*、*Harzia*和*Dactylonectria*。其中，刺盘孢菌属是优势属，占所有分离内生真菌的62%（16株中的10株）。鉴于菌株H10的独特形态和类型，文献检索显示目前关于从何首乌中分离的*C. boninense*菌株的次级代谢产物报道很少。因此，最终选择H10（*C. boninense*）进行大米固态发酵。
在形态学描述方面，H10菌落于28°C在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）上培养5–7天。菌落大、松散、棉絮状至绒毛状、干燥、不透明、牢固附着于培养基，表面白色至浅粉色或灰白色，背面浅黄至褐色；菌丝具隔膜、透明至浅褐色、分枝；生长速度快，7天后直径达60–70 mm；有霉味；光学显微镜（40×）下未观察到孢子。在分子鉴定方面，研究人员从新鲜菌丝体中提取基因组DNA，并使用引物对ITS4/ITS5和LR0R/LR5分别通过聚合酶链式反应（PCR）扩增核核糖体RNA基因的ITS区和LSU。获得的序列提交至NCBI GenBank并使用BLAST搜索进行比较。菌株H10与*C. boninense*显示100%序列相似性。基于形态学和分子数据的综合，菌株H10被鉴定为*C. boninense*。其栖息地为中国贵州省贵阳市乌当区（东经106.836223°，北纬26.791220°），菌株H10分离自叶片。系统发育位置分析表明，刺盘孢菌属物种是何首乌中的优势内生真菌，占所有分离菌株的62%（16株中的10株），属于小丛壳菌科（Glomerellaceae）、小丛壳菌目（Glomerellales）、粪壳菌纲（Sordariomycetes）。刺盘孢菌属的特征在于其快速生长的菌落、多样的色素沉着（白色、粉色、灰色或黑色）以及在标准培养条件下不产生可见孢子，这与先前关于内生刺盘孢菌物种的报道一致。
在化合物的分离方面，研究人员对H10菌株进行发酵，并使用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱和制备型高效液相色谱（HPLC）对其代谢物进行分离纯化。基于HR-ESI-MS、1H NMR、13C NMR和DEPT波谱数据以及文献比较，共获得22种已知化合物，包括甾体、聚酮、邻苯二甲酸酯、呋喃衍生物、含氮化合物、糖类、脂肪酸/脂肪醇衍生物和其他小分子代谢物。新化合物1–3从菌株H10的大米固态发酵培养物中获得，其结构通过NMR和MS分析鉴定。经文献和天然产物数据库（包括Dictionary of Natural Products、Reaxys、PubChem和CAS SciFinder）检索，未发现化合物1–3的先前报道。
化合物1为黄色油状物，其分子式C??H??NO?由高分辨电喷雾电离质谱（HRESI-MS）m/z 326.1361 [M+Na]?（计算值C??H??NO?Na，326.1368）推导得出，该分子式也提示化合物具有八个不饱和度和氢缺陷指数（IHD）。红外（IR）光谱在3416.27、3319.08、1522.96和1666 cm?1处显示明显吸收带，表明化合物1中存在相应的羟基、羰基和氨基。1H NMR谱显示一个甲基信号、三个亚甲基信号以及低场区的五个质子信号。13C-DEPT NMR和HSQC谱显示该化合物有17个碳，包括一个甲基碳、三个亚甲基碳、九个次甲基碳和四个季碳信号。关键的异核多键相关（HMBC）以及1H-1H COSY相关明确证实了m1的平面结构。为进一步阐明绝对构型，研究人员在mPW1PW91/SVP理论水平上对m1进行了电子圆二色（ECD）计算，实验ECD谱与计算ECD谱完美匹配。化合物1的相对和绝对构型通过CuKα射线X射线单晶衍射明确确证，Flack参数为?0.05，最终确定其绝对构型并命名为m1。
化合物2为黄色油状物，HRESI-MS: m/z 343.1518 [M+Na]?，推导出分子式C??H??O?（计算值C??H??O?Na为343.1512），该分子式提示化合物具有七个不饱和度（IHD）。IR光谱νmax 3386.43、2918.10和1682.96 cm?1推测化合物2中存在羟基和羰基。1H-NMR谱显示一个甲基信号、一个甲氧基信号、四个亚甲基信号以及低场区四个质子信号。13C-DEPT NMR谱显示该化合物有18个碳，包括两个甲基碳、四个亚甲基碳、八个次甲基碳和四个季碳信号（一个醛碳信号和一个羰基信号）。通过二维NMR数据推导出化合物的平面结构，HMBC谱确定了羰基和甲氧基的位置。根据NOESY信号和ECD数据确定其构型，该化合物被揭示为一种新的、天然的、罕见化合物，命名为m2。
化合物3为白色粉末，IR光谱νmax 3398、2922、1653和1073 cm?1推测化合物3中存在羟基、羰基和氨基。其分子式C??H??NO?由HRESI-MS: m/z 622.3904 [M+Na]?（计算值C??H??NO?Na，622.3931）推导得出，该分子式提示化合物具有五个不饱和度和氢缺陷指数（IHD）。MS/MS分析提供了详细的碎裂途径。1H-NMR谱显示三个甲基信号和15个亚甲基信号，13C-DEPT NMR谱显示该化合物有32个碳，包括三个甲基碳、15个亚甲基碳、八个次甲基碳、两个季碳信号和一个氨基信号。详细的2D-NMR研究（HSQC、1H-1H-COSY和HMBC实验）确定了m3的平面结构，该化合物为一种烯酰胺化合物，命名为m3，其构型通过分析数据和实测ECD数据确定。
在讨论部分，研究人员指出，本研究从贵州省采集的药用植物何首乌中分离出16株内生真菌。分类学鉴定显示刺盘孢菌属是该宿主内生真菌群落中的优势类群，占总分离物的62%。刺盘孢菌属隶属于子囊菌门（Ascomycota）、小丛壳菌目（Glomerellales），是与热带、亚热带和暖温带森林植物叶片和枝条相关的最普遍的内生真菌群之一。温暖潮湿的环境促进其孢子萌发、附着胞形成和宿主组织定殖。贵州省具有亚热带湿润季风气候，有利于刺盘孢菌属的生长。许多报道表明，刺盘孢菌在健康宿主组织中显示出最高的分离频率，且该真菌能够根据环境因素和宿主条件在内生和致病生活方式之间切换。研究人员从贵州省湿气候区采集的何首乌样品中观察到刺盘孢菌，进一步支持了该属对温暖潮湿栖息地和药用植物宿主的强适应性。然而，对作为内生真菌的*C. boninense*的次级代谢产物研究仍然有限；现有研究多集中于其作为植物病原真菌的致病性而非其作为内生菌的化学多样性。因此，研究人员选择菌株H10作为目标菌株，并采用大米固态发酵系统探索其次级代谢产物，以阐明该菌株的化学特征。
从菌株H10中分离并鉴定出25种次级代谢产物，包括三种新天然产物（m1–m3）和22种已知化合物；其结构类型包括甾体、聚酮、生物碱、碳水化合物和脂肪酸。m1是麦角甾烷型衍生物，而m2和m3是solanapyrone型聚酮化合物。Solanapyrone型聚酮长期以来主要从植物病原真菌（如*Alternaria*和*Ascochyta*）中报道。其生物合成由典型的迭代I型聚酮合酶（iPKS）基因簇（sol基因簇）控制，末端步骤由Diels–Alderase Sol5催化以构建双环骨架。近年来，此类化合物也已在与药用植物相关的内生真菌中发现。例如，研究人员从丹参内生真菌*Alternaria tenuissima* SP-07的提取物中分离出三种新的吡喃酮化合物solanapyrones P–R，以及已知的solanapyrones和苯并吡喃酮。此外，在*Alternaria tenuissima*的代谢物谱中检测到solanapyrone G等吡喃酮成分。在本研究中，研究人员从内生刺盘孢菌菌株中获得了具有这种新骨架的化合物，不仅扩展了solanapyrone型代谢物的真菌来源范围，而且为该属的化学分类学提供了新的化学证据，表明这些聚酮可能作为物种水平化学分类学的参考代谢物。
内生真菌与其宿主何首乌形成共生关系。然而，菌株H10生物合成的甾体和聚酮代谢物是否赋予宿主抗逆性或抗病虫害能力仍有待阐明。在初步研究中，仅进行了基本的活性筛选，未观察到显著的生物活性。早期报道表明，solanapyrone型化合物具有植物毒性、抗菌和抗肿瘤活性，而麦角甾烷型衍生物通常表现出抗炎、免疫调节等活性。因此，未来的研究应采用更广泛的筛选模型，对三种新化合物进行系统的生物活性评价，以揭示其生物学作用和药物发现前景。
本研究存在若干局限性。首先，仅使用了一种培养方式——大米固态发酵。真菌次级代谢产物的生物合成高度依赖培养条件；培养基配方、温度、pH或培养时长的变化可能激活沉默的生物合成途径并产生额外的结构独特代谢物。其次，仅研究了菌株H10。从何首乌中分离的其他15株内生真菌尚未被研究，其化学潜力仍未被探索。第三，代谢物分析仅在体外发酵条件下进行。菌株H10是否在何首乌植物体内原位产生这些代谢物以及它们在宿主内的实际生理浓度仍有待通过代谢组学验证。
总之，本研究扩大了何首乌内生真菌的化学资源，并为后续从刺盘孢菌内生真菌中挖掘代谢物提供了菌株资源。未来的工作可应用OSMAC（一菌多化合物）策略改变培养条件以激活沉默的生物合成基因簇。同时，可结合基因组挖掘分析该菌株的生物合成基因簇，并阐明三种新化合物的生物合成途径。这些工作将为新型天然产物的发现和利用奠定理论基础。
在材料与方法部分，研究人员使用了多种实验室仪器，包括Bruker AM-600 NMR波谱仪、Bruker Vertex 70 FT-IR红外光谱仪、Varian Cary 50 UV/VIS紫外光谱仪、JASCO-810圆二色光谱仪、Thermo Fisher LTQ XL LC/MS高分辨质谱仪以及配备石墨单色器Cu Kα辐射源的Rigaku Oxford单晶衍射仪。半制备型HPLC使用Agilent 1200，流速为2 mL/min。本研究中使用的何首乌样品采集自中国贵州省贵阳市乌当区，经贵州中医药大学董丽莎鉴定为Polygoni Multiflori Radix。随后从新鲜何首乌叶片中分离纯化*C. boninense*。
在内生真菌的分离和鉴定中，研究人员从何首乌的纤维根、块根、茎和叶中分离纯化内生真菌。材料经无菌水冲洗和表面消毒后，根组织切成约0.5 cm3的小块，叶片切成约0.5 cm2的薄片，接种于PDA固体培养基上，在28°C恒温培养3–7天。待切边与培养基接触处长出菌丝后，挑取菌丝通过划线法纯化获得形态特征明显的内生真菌。基因组DNA按照EZgene真菌基因组DNA提取试剂盒（B518259）的说明提取。分子鉴定通过PCR扩增真菌内转录间隔区（ITS）和核糖体LSU rRNA基因进行，ITS区域使用引物对ITS5/ITS4扩增，LSU基因使用引物对LR0R/LR5扩增。
在发酵和提取过程中，内生真菌菌株H10最初在PDA上于28°C培养纯化。种子培养制备时，将真菌块（1×1 cm）接种到含有100 mL马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）的250 mL锥形瓶中，于28°C在旋转摇床上以140 rpm培养。培养5天后，种子培养物用于固态发酵。每个菌株使用30 kg糙米作为固态发酵基质。将大米分装到灭菌袋中（每袋50 g），与等体积蒸馏水混合（1:1，w/v），在121°C灭菌30分钟。冷却至室温后，每袋在无菌条件下接种6 mL种子培养物。发酵在28°C下进行20天。对于化合物提取，将发酵米培养物浸泡在70%乙醇中30天。收集上清液，菌丝体和残余大米用70%乙醇再提取一次。合并乙醇提取物后在45°C下真空浓缩。所得水相残留物依次用石油醚、乙酸乙酯（EtOAc）和正丁醇（nBuOH）萃取。H10获得乙酸乙酯提取物。
在次级代谢产物的分离中，研究人员对菌株H10的乙酸乙酯和正丁醇部分进行了系统分离。乙酸乙酯部分首先通过100–200目正相硅胶柱色谱分离，使用石油醚–乙酸乙酯和二氯甲烷–甲醇两种溶剂系统进行梯度洗脱，合并相似流分得到八个部分。HPLC和TLC分析显示化合物主要富集在二氯甲烷:甲醇5:1和石油醚:乙酸乙酯1:1部分。二氯甲烷:甲醇5:1部分经ODS柱分离并经半制备HPLC反复纯化得到相应单体化合物。正丁醇部分干燥提取物与100–200目正相硅胶按1:1.2（w/w）比例混合，装柱后用二氯甲烷–甲醇系统（20:1、10:1、5:1、3:1、2:1、1:1和1:2）梯度洗脱，最终用乙酸乙酯和甲醇依次洗涤，共获得九个部分。其中二氯甲烷:甲醇20:1（Fr20）和10:1（Fr10）部分被选择进行进一步分离。Fr10经正相硅胶柱色谱进一步细分，Fr9重结晶得到化合物m1；Fr12经半制备HPLC（60%乙腈–水，15分钟）纯化得到化合物m2。Fr20经正相硅胶柱色谱细分后，其Fr9进一步在ODS柱上分离获得10个亚流分，其中Fr3经制备HPLC（55%乙腈–水，35分钟）纯化得到化合物m3。其余不纯部分根据其组成通过Sephadex LH-20凝胶柱色谱和重复半制备HPLC选择性纯化，最终获得上述单体化合物。
在真菌次级代谢产物的鉴定中，对分离得到的每个单体化合物，首先测定紫外光谱以评估共轭体系，记录红外光谱以鉴定羟基、羰基和氨基等官能团，并测定旋光度。随后使用高分辨电喷雾电离质谱（HR-ESI-MS）根据[M+Na]?或[M+H]?的精确质量推导分子式和不饱和度。然后应用一维核磁共振波谱（包括1H NMR、13C NMR和DEPT）归属碳和质子信号，区分甲基、亚甲基、次甲基和季碳，并鉴定羰基和双键等结构片段。进一步采用二维核磁共振波谱（包括1H–1H COSY、HMBC和NOESY）推导相邻片段的连接性、平面结构和相对构型。对于新化合物，额外测量ECD并与计算或文献ECD数据比较以确定绝对构型。对于能培养成单晶的化合物，使用单晶X射线衍射作为补充手段直接确证其立体结构。对于已知化合物，将获得的MS和NMR数据与已发表的文献数据进行比较，直接确定其结构。
