从抑制到降解：半乳糖凝集素-3能否通过异双功能降解剂实现药物靶向？

《Molecules》：From Inhibition to Degradation: Can Galectin-3 Be Drugged by Heterobifunctional Degraders?

　　

几种纳摩尔级别的半乳糖凝集素-3抑制剂已进入临床评估阶段，这表明半乳糖凝集素-3是一个可成药的靶点。这些小分子抑制剂通过与靶蛋白结合发挥作用，依赖于占位驱动的药理学作用模式，可能无法完全解决半乳糖凝集素-3的细胞内功能。蛋白水解靶向嵌合体代表了一种替代性治疗模式，能够通过事件驱动的作用模式实现细胞内靶蛋白的清除。半乳糖凝集素-3同时存在于细胞内和细胞外；然而，PROTAC只能接触细胞内的那部分，这引发了关于选择性细胞内降解是否能提供足够治疗益处的疑问。本前瞻性评述审视了由糖模拟配体、E3连接酶招募配体和连接链组成的异双功能性半乳糖凝集素-3靶向分子。研究人员对其结构、降解相关数据和机制进行了批判性评估。讨论了关键挑战，包括连接链优化、配体亲和力和细胞内靶点可及性。一项非常近期研究表明，实现了强效且选择性的半乳糖凝集素-3降解，并将靶向蛋白降解扩展到了结构上具有挑战性的凝集素。总体而言，半乳糖凝集素-3提供了一个原理验证，表明经历细胞内-细胞外转运的半乳糖凝集素有可能被PROTAC降解。

研究背景与现存问题

半乳糖凝集素是一类β-半乳糖苷结合凝集素，参与细胞间及细胞与基质间的相互作用、糖蛋白运输和免疫信号传导。其中，半乳糖凝集素-3因其在癌症、纤维化和炎症性疾病中的多功能作用而成为一个极具吸引力的治疗靶点。它在乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌和黑色素瘤等多种癌症中过表达，而在特发性肺纤维化等纤维化疾病中，它促进成纤维细胞活化、增殖和细胞外基质沉积。其由巨噬细胞和单核细胞分泌的特性以及在细胞内和细胞外区室的定位，凸显了其在连接免疫失调与组织重塑及慢性炎症中的核心作用。

目前大多数治疗努力集中在开发小分子抑制剂和糖模拟物上，旨在破坏其碳水化合物识别域与天然配体的结合，已产生如Selvigaltin和TD139/GB0139等临床候选药物。此外，Galectin Therapeutics开发的多糖聚合物Belapectin正处于MASH肝硬化治疗的二期临床试验中。然而，这些方法仍受限于占位驱动的药理学作用模式。更重要的是，半乳糖凝集素-3参与的蛋白质-蛋白质相互作用和细胞内信号传导事件不太可能被竞争性抑制剂完全阻断，这突显了对能够实现更强健、更持久靶点抑制的替代性治疗模式的需求。

研究内容与结论

靶向蛋白降解通过实现对疾病相关蛋白的选择性消除而非瞬时抑制其活性，提供了这样一种替代方案。蛋白水解靶向嵌合体是由一个目标蛋白配体通过连接链与一个E3泛素连接酶招募配体相连组成的异双功能分子。PROTAC促进目标蛋白与E3连接酶形成三元复合物，从而启动目标蛋白的泛素化及随后的蛋白酶体降解，实现事件驱动的药理学作用模式。值得注意的是，PROTAC只需与靶蛋白进行瞬时结合即可启动降解，这可能有助于克服许多半乳糖凝集素配体相对较弱的结合亲和力——尽管基于半乳糖的支架的高极性表面积限制了细胞通透性并约束了连接链设计。

Liu等人的专利首次提出将PROTAC策略扩展到半乳糖凝集素-3，公开了一系列将半乳糖凝集素-3结合部分与E3泛素连接酶结合配体相连的双功能化合物。这些分子被明确提议作为半乳糖凝集素-3降解剂或抑制剂，引入了从靶点抑制到靶点清除的概念转变。随后发表的同行评审研究验证并扩展了这一概念，鉴定出了高效的降解剂并在细胞环境中证明了其活性。

关键技术方法

本研究采用的关键技术方法包括：基于BRET的CRBN靶点参与实验以测定化合物对CRBN的结合活性；HTRF实验用于测定化合物对半乳糖凝集素-3的结合亲和力；ELISA和Western印迹法用于定量检测THP-1人单核白血病细胞系、NHLF正常人肺成纤维细胞、A549肺腺癌细胞系、LL29特发性肺纤维化患者肺成纤维细胞和NIH/3T3小鼠胚胎成纤维细胞中半乳糖凝集素-3的蛋白水平；全局蛋白质组学分析用于评估降解剂在全蛋白质组范围内的选择性；平行人工膜渗透性实验和肝微粒体稳定性实验分别用于评估化合物的细胞渗透性和代谢稳定性。

研究结果

2.1 半乳糖凝集素结合部分

目标蛋白配体部分源自经过优化的高级糖模拟支架，旨在与半乳糖凝集素-3的CRD进行高亲和力相互作用。晶体结构分析显示，关键的氢键、阳离子-π相互作用、π-π堆积以及范德华接触得以保留。2号位的羟基指向溶剂，因此适合用于连接链的连接。

2.2 E3连接酶招募配体的选择

专利中一致采用了含有戊二酰亚胺结构的支架，在结构上类似于免疫调节酰亚胺类药物，包括沙利度胺、来那度胺和泊马度胺衍生物的特征性异吲哚啉酮和邻苯二甲酰亚胺样基序，而同行评审研究中仅描述了CRBN招募剂。少数VHL和DCAF15招募的双功能分子也在专利中被制备。CRBN靶点参与实验证明这些化合物保留了在细胞环境中结合CRBN的能力，这是PROTAC功能的一个关键特征。

2.3 连接链架构与设计考量

所公开化合物的一个决定性特征是连接链架构的多样性，包括亚烷基链、醚类和酰胺连接间隔基。连接链常引入聚乙二醇样基团和极性官能团以增强灵活性和溶解性。连接链的设计对于调节三元复合物形成、整体细胞活性和药代动力学性质至关重要，其优化通常依赖于试错法。不恰当的连接链可能导致“钩状效应”，即在高浓度下因二元复合物增多导致三元复合物减少，从而降低降解效率。

2.4 功能活性与降解研究

专利建立了半乳糖凝集素-3可通过蛋白降解策略靶向的初步证据，而近期同行评审研究提供了定量的、全蛋白质组范围的验证。CRBN BRET参与实验和hGal-3 HTRF实验测定了各异双功能分子的IC₅₀值。专利中通过ELISA观察到的半乳糖凝集素-3水平降低提示成功招募了泛素-蛋白酶体系统，但未明确报告DC₅₀和D_max等降解参数，也未直接展示靶蛋白泛素化、蛋白酶体依赖性实验或三元复合物形成的定量表征。

近期研究通过Western印迹法证明了半乳糖凝集素-3的降解，这是相对于专利披露最重要的进展之一。化合物5在NHLF细胞中的剂量依赖实验中显示出最优的整体活性谱，确定了关键PROTAC活性参数（DC₅₀=4 nM，72小时孵育）。全局蛋白质组学分析表明，化合物6在THP-1细胞中诱导了半乳糖凝集素-3的剂量依赖性降解，DC₅₀值为10.7 nM，且在超过7800个定量蛋白中表现出选择性，包括其他半乳糖凝集素家族成员。活性降解剂与非降解化合物7和阴性对照17的比较表明，仅具备对半乳糖凝集素-3的亲和力不足以诱导降解，还需要有效的E3连接酶招募和随后的三元复合物形成。

总结与讨论

半乳糖凝集素-3靶向降解剂代表了靶向蛋白降解超越传统细胞内靶点类别的最引人注目的近期实例之一。从专利公开到后续同行评审验证的进展表明，通过对靶点结合、CRBN招募、连接链架构和理化性质的合理优化，可以产生针对治疗相关凝集素的高效且选择性降解剂。实现低纳摩尔降解效力的降解剂的发现凸显了高效三元复合物形成（而非单纯的靶点结合）对决定生物学活性的重要性。

PROTAC介导的半乳糖凝集素-3靶向可能在原则上解决经典抑制剂的若干局限性。然而，该方法也面临重大挑战：糖模拟配体和抑制剂通常极性强且结构复杂，可能限制细胞渗透性、代谢稳定性和构象灵活性；半乳糖凝集素-3相对平坦的结合表面可能不支持协同的三元复合物形成；由于PROTAC活性仅限于细胞内泛素-蛋白酶体机器，只有一部分半乳糖凝集素-3库是可及的，这引发了一个悬而未决的问题：选择性清除细胞内半乳糖凝集素-3是否足以达到治疗效果，还是细胞外部分的半乳糖凝集素-3会限制该方法的整体影响。

研究结论：Liu等人通过Western印迹和全局蛋白质组分析鉴定出了高效且选择性的半乳糖凝集素-3降解剂，为传统抑制提供了一种有潜力的替代方案。通过清除半乳糖凝集素-3本身，降解剂可能同时抑制配体依赖性和非依赖性功能，提供一种基于占位的方法可能无法实现的通路调节程度。这种机制优势是否能转化为更优的治疗益处仍是一个重要问题，但该概念现在得到了比专利数据更强的实验证据支持。尽管如此，仍需进一步研究来确定体内疗效、药代动力学-药效学关系以及在疾病模型中长期清除半乳糖凝集素-3的后果。