巨噬细胞膜伪装MOF818纳米酶递送鸢尾黄素治疗脂多糖诱导急性肺损伤的研究

《International Journal of Nanomedicine》：Macrophage-Associated Delivery of Tectorigenin by MOF818 Nanozyme for the Treatment of LPS-Induced Acute Lung Injury

　　

摘要 引言：急性肺损伤（ALI）是一种危及生命的炎症性肺部疾病，其特征为过度炎症、氧化应激及肺组织完整性破坏。巨噬细胞功能失调在ALI进展中起关键作用，因此调控巨噬细胞成为潜在的治疗策略。鸢尾黄素（Tec）是一种具有抗炎活性的天然异黄酮类化合物，已在炎症性疾病中显示出保护作用，但其在ALI中的作用机制及巨噬细胞靶向递送尚不清楚。在此，研究人员开发了一种巨噬细胞膜伪装的MOF818纳米酶用于Tec的巨噬细胞靶向递送，命名为T-M@MM，以增强其对ALI的治疗效果。 方法：在脂多糖（LPS）诱导的ALI小鼠模型及LPS或叔丁基过氧化氢（TBHP）刺激的RAW264.7巨噬细胞中评估了Tec和T-M@MM的效果。采用巨噬细胞清除、网络药理学、分子对接及细胞热转变分析（CETSA）研究其潜在机制。通过分子及细胞实验评估巨噬细胞极化、糖酵解、氧化应激、线粒体功能及凋亡。进一步评价了T-M@MM的理化性质、Tec载药与释放特性、巨噬细胞摄取、肺部生物分布、生物安全性及治疗效果。 结果：Tec减轻了肺部炎症和氧化应激，促进了抗炎型巨噬细胞表型，而巨噬细胞清除则减弱了这些效应。PFKFB3被确定为与Tec作用相关的潜在分子靶点，Tec抑制了PFKFB3相关的糖酵解并促进抗炎型巨噬细胞极化，而PFKFB3过表达则削弱了这些作用。T-M@MM实现了Tec的负载并表现出pH/活性氧（ROS）响应性释放、增强的巨噬细胞摄取和肺部滞留（>48小时），以及强大的ROS清除活性。在LPS诱导的ALI小鼠中，T-M@MM减轻了肺部炎症、氧化应激、水肿和病理损伤，且在主要器官组织学、肝肾功能或体重方面未见明显异常。 结论：T-M@MM整合了巨噬细胞靶向、ROS清除以及Tec介导的PFKFB3相关糖酵解调控，从而调节巨噬细胞反应并改善LPS诱导的ALI，初步证据显示其具有良好的生物相容性，提供了一种潜在的巨噬细胞靶向纳米治疗策略。

一、研究背景与目的

急性肺损伤（ALI）及其严重形式急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是危及生命的疾病，以弥漫性肺泡损伤、肺水肿和强烈炎症反应为特征，死亡率居高不下。脓毒症是其最重要的临床诱因之一。巨噬细胞是调控ALI病理进程的核心细胞，在ALI病理微环境中，巨噬细胞优先极化为促炎的M1表型，分泌大量促炎细胞因子，加剧肺损伤。研究表明，炎症性巨噬细胞活化与代谢重编程密切相关，ALI中的炎症刺激可增强巨噬细胞的糖酵解活性以支持其促炎功能。PFKFB3作为糖酵解的重要调控因子，可通过调节糖酵解通量促进炎症性巨噬细胞活化和M1极化。此外，过量的活性氧（ROS）是ALI发病和进展的核心驱动因素。因此，靶向巨噬细胞以减少其ROS产生、调节M1/M2平衡并促进其向M2表型极化，被认为是一种极具前景的治疗策略。

鸢尾黄素（Tec）是一种从射干和葛花中分离的异黄酮类化合物，具有抗炎和抗氧化活性，对多种炎症性疾病显示出治疗潜力，但其在ALI中的作用机制尚不明确，且水溶性差、递送效率低限制了其临床转化。金属有机框架（MOF）MOF818是一种含铜和锆的MOF，具有仿生抗氧化酶活性，可清除过量ROS并促进巨噬细胞从M1向M2表型极化。巨噬细胞衍生细胞膜保留了多种膜蛋白、黏附分子和趋化因子相关受体，赋予膜包被纳米颗粒炎症趋向性。为解决上述相互关联的病理特征，研究人员开发了一种多功能纳米平台T-M@MM，将Tec封装入MOF818核心，再以巨噬细胞来源细胞膜伪装，整合巨噬细胞靶向递送、Tec的免疫调节活性和MOF818的ROS清除活性，旨在同时应对LPS诱导ALI的两大病理组分——巨噬细胞介导的炎症和过度氧化应激，同时克服Tec水溶性差和递送效率有限的缺陷。

二、主要关键技术方法

研究人员采用两步溶剂热法合成MOF818；通过差速离心法提取经LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞膜；将MOF818分散于Tec乙醇溶液中搅拌吸附制备载药复合物Tec@MOF818（T-M），再与M1巨噬细胞膜悬液超声混合得到T-M@MM。利用透射电镜（TEM）、Zeta电位、动态光散射（DLS）、元素映射、X射线光电子能谱（XPS）、X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）及蛋白质印迹法表征材料。采用高效液相色谱（HPLC）测定载药量与包封率，并在不同pH及H₂O₂条件下评估药物释放。通过CCK-8法、共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和流式细胞术评估细胞活力、摄取及巨噬细胞极化。利用海马（Seahorse）代谢分析仪测量细胞外酸化率（ECAR）和耗氧率（OCR）。采用DCFH-DA、MitoSOX和JC-1探针检测ROS和线粒体功能。通过Annexin V/PI染色评估凋亡。使用C57BL/6小鼠（雄性，6-8周龄，购自湖北宜昌三峡大学）建立LPS诱导ALI模型（气管内滴注4 mg/kg LPS），2小时后给予不同治疗，24小时后处死取样。通过苏木精-伊红（H&E）染色、免疫荧光（IF）染色、免疫组化（IHC）染色、酶联免疫吸附试验（ELISA）及蛋白质印迹法评估肺部病理、炎症和氧化应激指标。

三、研究结果

Tectorigenin通过巨噬细胞调控改善ALI

H&E染色显示Tec减轻了肺泡结构破坏和炎症细胞浸润；ZO-1免疫荧光染色表明Tec恢复了肺组织完整性和ZO-1表达；IHC和ELISA结果显示Tec剂量依赖性降低IL-1β、IL-6和TNF-α水平；DHE染色显示Tec减少肺部ROS积累；CD86免疫染色和qRT-PCR证实Tec减少M1巨噬细胞数量并上调CD206 mRNA表达。巨噬细胞清除实验（氯膦酸脂质体）表明，肺部巨噬细胞清除后Tec的保护作用显著消失，证明巨噬细胞在Tec治疗ALI中发挥关键作用。

Tectorigenin调控巨噬细胞中PFKFB3相关糖酵解

流式细胞术和免疫荧光显示Tec减少LPS诱导的M1巨噬细胞比例。网络药理学筛选出108个ALI相关候选靶点，分子对接显示PFKFB3与Tec结合亲和力最高。蛋白质印迹法证实Tec降低PFKFB3及糖酵解相关蛋白（LDHA、HIF-1α、HK2）表达。海马代谢分析表明Tec显著降低ECAR并增加OCR。细胞热转变分析（CETSA）提示Tec可能改变PFKFB3的热稳定性。PFKFB3过表达挽救实验表明，过表达PFKFB3逆转了Tec诱导的M2极化促进作用并部分恢复p65磷酸化。

T-M@MM的合成与表征

TEM观察到T-M@MM表面清晰的膜层；Zeta电位由正变负；DLS显示粒径增大至约240 nm；元素映射和XPS确认元素组成；共定位成像验证膜成功包被；XRD和FTIR表明晶体结构和成分未受破坏；蛋白质印迹法确认膜标志物CD18、CCR2、CD40和CD47的表达。载药量为11.05%，包封率为79.95%。药物释放呈缓释特性，在酸性（pH 5.6）和高ROS（10 μM H₂O₂）条件下释放加速。胶体稳定性良好。

T-M@MM被巨噬细胞高效摄取并靶向炎症肺组织

CCK-8确定5 μg/mL为工作浓度。免疫荧光证实巨噬细胞内化了T-M@MM的膜和核组分。M1巨噬细胞对M@MM和T-M@MM的摄取强于M0。体内荧光成像显示T-M@MM在肺部滞留超过48小时，且肺部荧光强度高于裸MOF818，离体成像确认主要积聚于肺。

T-M@MM在体外清除ROS并抑制凋亡

ABTS和TMB显色实验证实T-M@MM剂量依赖性地清除自由基；SOD活性检测显示IC₅₀约为4.64 μg/mL。DCFH-DA和MitoSOX探针表明T-M@MM有效降低细胞内总ROS和线粒体ROS。蛋白质印迹法显示T-M@MM上调HO-1、Nrf2和GPX4等抗氧化蛋白表达。JC-1染色表明T-M@MM恢复线粒体膜电位。Annexin V/PI染色显示T-M@MM最佳地减少了TBHP诱导的细胞凋亡。

T-M@MM调控巨噬细胞极化并抑制糖酵解

qRT-PCR显示T-M@MM下调M1标志物（iNOS、TNF-α、CD86）mRNA，上调M2标志物（CD206、Ym1、IL-10）mRNA。免疫荧光和蛋白质印迹法一致显示T-M@MM降低CD86、iNOS和TNF-α蛋白水平，升高CD206和Arg-1水平。蛋白质印迹法还表明T-M@MM显著下调PFKFB3及HIF-1α、HK2和LDHA等糖酵解相关蛋白表达。

T-M@MM在体内改善ALI并调控氧化应激/糖酵解

H&E染色显示T-M@MM最有效地改善了肺泡壁增厚和肺组织结构紊乱；IHC和ELISA表明T-M@MM最大程度降低了IL-1β、IL-6和TNF-α水平及肺湿干比。CD86免疫荧光显示T-M@MM减少M1巨噬细胞浸润；ZO-1染色证实其改善肺组织完整性；DHE染色显示其最低的肺部ROS水平。Nrf2免疫荧光显示T-M@MM最强地上调Nrf2并诱导其核转位。蛋白质印迹法证实T-M@MM最有效地上调GPX4、HO-1、Nrf2和IL-10表达，并抑制糖酵解相关蛋白。生物安全性评估显示，治疗后1、7、14天主要器官组织学、肝肾功能及体重均无明显异常。

四、讨论与结论

本研究成功构建了一种仿生MOF818基纳米平台T-M@MM，用于巨噬细胞相关递送Tec，并评估其在LPS诱导ALI中的治疗潜力。机制上，Tec调控PFKFB3相关糖酵解，促进巨噬细胞从促炎M1表型向抗炎M2表型极化，减轻炎症反应。同时，MOF818发挥内在ROS清除活性，调控氧化应激、保护线粒体功能并减少细胞凋亡。体外摄取和体内荧光成像证实了T-M@MM增强的巨噬细胞摄取和肺部蓄积能力。体内实验表明T-M@MM减轻了肺部病理损伤、炎症反应和氧化应激。在1、7和14天观察期内未发现体重及主要器官组织学的明显异常，提供了初步的生物安全性证据。本研究建立了一个整合Tec介导的免疫代谢调控、MOF818介导的ROS清除和巨噬细胞相关递送的多功能纳米平台，为LPS诱导的ALI提供了一种潜在的治疗策略。