Escovopsioides nivea次生代谢产物的化学表征及其对切叶蚁真菌互惠体Leucoagaricus gongylophorus的拮抗活性

《Molecules》：Chemical Characterization of Secondary Metabolites of Escovopsioides nivea and Their Antagonistic Activity Against the Leaf-Cutter Ant Fungal Mutualist Leucoagaricus gongylophorus

　　

Escovopsioides属微真菌是真菌种植蚁（Tribe Attini）与其真菌栽培种之间专性共生体系中的拮抗者，但其相互作用的化学基础仍 largely unexplored。与近缘Escovopsis属物种类似，Escovopsioides属物种常与担子菌Leucoagaricus gongylophorus（由切叶蚁维持的真菌栽培种）表现拮抗互作。本研究从巴拿马中部采集的高级切叶蚁Acromyrmex octospinosus和Mycetomoellerius mikromelanos巢中分离E. nivea菌株。选择一株来自A. octospinosus巢的菌株进行化学研究并评价其对L. gongylophorus的拮抗活性。采用一维和二维核磁共振（NMR）波谱结合电喷雾电离质谱（ESIMS）进行化学分析，从E. nivea中鉴定出5个已知次生代谢产物：rugulotrosin A (1)、microthecin (2)、2-(1-oxo-2-hydroxyethyl)furan (3)、chrysophanol (4)和physcion (5)。针对L. gongylophorus的生物测定显示，rugulotrosin A (1)、chrysophanol (4)和physcion (5)在100 μg浓度下表现出中等拮抗活性。据研究人员所知，这是首次报道Escovopsioides属成员产生次生代谢产物并证明其对真菌种植蚁互惠真菌栽培种具有拮抗活性。这些发现拓宽了Escovopsioides已知化学多样性，并为与真菌种植蚁共生相关的微真菌拮抗者的生态功能和进化意义提供了新见解。

该研究围绕真菌种植蚁（Tribe Attini）与其真菌栽培种之间专性互惠共生体系中的微真菌拮抗者展开。该多营养级共生网络包括蚂蚁、担子菌栽培种、放线菌、Escovopsis类微寄生真菌及黑酵母等；次生代谢产物（secondary metabolites）被认为是种间化学互作的重要介质，但Escovopsioides属与栽培种L. gongylophorus拮抗关系的化学基础仍不清楚。E. nivea能抑制L. gongylophorus生长，然而负责该活性的化合物尚未明确。为此，研究人员从巴拿马中部采集的A. octospinosus和M. mikromelanos巢中分离E. nivea，选择代表菌株开展化学与生物活性研究，以阐明其代谢产物及生态功能；结论是首次从E. nivea中鉴定5个已知次生代谢产物，其中3个具中等拮抗活性，拓宽了Escovopsioides的化学多样性，并为共生体系化学互作及Escovopsis群演化提供依据。

技术方法（不超过250字）：2022—2025年在巴拿马中部采集20个A. octospinosus巢和8个M. mikromelanos巢，取菌圃材料湿室分离并以PDA纯化；以形态和ITS序列及BLASTn确认种属，GenBank登录号为PZ972686和PZ972687。构建44条ITS序列数据集，以最大似然法（ML）和1000次超快自举（UFBoot）重建系统发育。PDA培养后经乙酸乙酯提取，采用VLC/SPE和高效液相色谱（HPLC）纯化；以1D/2D核磁共振（NMR）和电喷雾电离质谱（ESIMS）鉴定化合物。以PDA琼脂扩散法测试100 μg化合物对L. gongylophorus的拮抗活性，Nystatin（50 μg）为阳性对照，DMSO为阴性对照。

2.1. Prevalence of Escovopsioides in Fungus Gardens of Attine Ant Nests（Escovopsioides在切叶蚁巢菌圃中的流行率）：通过菌圃分离与流行率调查，E. nivea在A. octospinosus巢中检出率为10%（2/20），在M. mikromelanos巢中为12.5%（1/8）；作者与Augustin et al.在巴西3种Acromyrmex的14/25（56%）及Mendon?a et al.的8.3%（12巢）等数据比较，并提及Pietrobon et al.在巴西8个地点6类生境的广泛发生及Reis et al.将E. nivea列为12个采样巢中第二常见真菌。结论是这些结果扩展了Escovopsioides已知地理分布，并提示E. nivea在切叶蚁巢菌圃中持续出现。研究以透明菌丝和无色素等形态特征区别于Escovopsis，并结合分子鉴定确认来自A. octospinosus的分离株；其生长缓慢，Ostis and Rodrigues曾显示巢内外源微生物可抑制培养中的Escovopsioides，可能解释流行率差异。

2.2. Escovopsioides nivea Strains on Escovopsis Group Phylogeny（Escovopsioides nivea菌株在Escovopsis群系统发育中的位置）：通过ML系统发育重建，所有属被解析为独立分支；Attini相关主要谱系形成单系分支，UFBoot为98–100%，外群将非Attini肉座菌目真菌分开。来自巴拿马的两个新序列与4条参考序列聚集于Escovopsioides分支，UFBoot为100%；Escovopsioides与Luteomyces为姐妹群，UFBoot为89%；巴拿马样品最接近E. nivea（MF116029），支持其强系统发育亲缘关系。

2.3. Antagonistic Interaction of Escovopsioides and Leucoagaricus（Escovopsioides与Leucoagaricus的拮抗互作）：通过克隆内和种间配对实验，L. gongylophorus克隆内无拮抗；E. nivea克隆内10天后出现接触抑制，尽管两组均发生物理接触；L. gongylophorus与E. nivea种间配对产生0.85 ± 0.17 cm抑菌带，表明二者存在明确拮抗反应，与既往报道一致。

2.4. Chemical Characterization of Secondary Metabolites from E. nivea（E. nivea次生代谢产物的化学表征）：通过PDA培养及NMR、ESIMS分析，鉴定5个化合物。化合物1为rugulotrosin A，黄色固体，[M+H]⁺为639，分子式C₃₂H₃₁O₁₄，属二聚四羟基??酮类，曾从土壤Penicillium sp.发现并具抗菌活性；2为microthecin，[M+Na]⁺为167.0315，分子式C₆H₈O₄Na，来源于Morchella及红藻，具抗菌和细胞毒活性；3为2-(1-oxo-2-hydroxyethyl)furan，[M+H]⁺为127、[M+Na]⁺为149，来自Cornynascus setosus、Rhizoctonia solani和Morchella，具强抗自由基活性；4为chrysophanol，[M+H]⁺为255，分子式C₁₅H₁₁O₄，具抗癌、保肝、神经保护、抗炎、抗溃疡和抗菌等广谱活性，真菌中首次报道于Penicillium isladicum；5为physcion，与4相似且C-6有甲氧基，[M+H]⁺为285，分子式C₁₆H₁₃O₅，具多样生物活性。

2.5. Antagonist Bioassay of Compounds isolated from E. nivea Against L. gongylophorus（E. nivea化合物对L. gongylophorus的拮抗生物测定）：通过PDA琼脂扩散生物测定，microthecin（0 mm，N=1）、2-(1-oxo-2-hydroxyethyl)furan（0 mm，N=1）及DMSO（0 mm，N=3）无抑菌带；physcion（1.50 ± 0.55 mm，N=3）、chrysophanol（1.35 ± 0.37 mm，N=3）、rugulotrosin A（2.10 ± 1.12 mm，N=3）及Nystatin（50 μg，3.60 ± 2.91 mm，N=3）有抑制活性。结论是microthecin和2-(1-oxo-2-hydroxyethyl)furan无活性，physcion和chrysophanol轻微活性，rugulotrosin A抑菌带最大但仍低于阳性对照；physcion和chrysophanol与E. weberi来源emodin骨架相似，而emodin曾被报道对L. gongylophorus具抗真菌活性，支持E. nivea产生聚酮类混合物调控L. gongylophorus生长。

讨论部分总结：讨论将E. nivea的化学表型与其对L. gongylophorus的拮抗作用相联系，指出化合物4和5与emodin结构类似，支持聚酮类在Escovopsis群拮抗中的意义；比较基因组虽提示次生代谢生物合成通路，但原位验证缺乏，本研究提供基础数据。

研究结论翻译：E. nivea真菌在系统发育上与专性病原Escovopsis相关，并作为真菌拮抗者抑制L. gongylophorus生长。研究人员在此首次报道E. nivea产生的、具有拮抗活性的次生代谢产物的化学表征。此外，研究证明Escovopsis群真菌产生的聚酮类化合物，特别是rugulotrosin A (1)、chrysophanol (4)和physcion (5)，可有效抑制L. gongylophorus生长。这些化合物以广谱生物活性著称。化合物4和5是emodin的结构类似物，emodin是此前从E. weberi分离、对L. gongylophorus具强抑制活性的代谢物。这些抑制性次生代谢产物的表征回答了关于E. nivea在专性切叶蚁–担子菌互惠共生中生态作用的关键问题，也涉及Escovopsis群对互惠担子菌的菌寄生演化轨迹。尽管近期比较基因组研究已鉴定次生代谢产物生物合成途径，但化合物产生的原位验证仍缺乏。研究结果提供基础数据，将促进E. nivea及相关菌寄生真菌生物合成途径和生物合成基因簇（BGCs）的未来研究。