非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤微环境中星形胶质细胞与小胶质细胞的转录程序特征

《Cancers》：Astrocyte and Microglial Transcriptional Programs in the Atypical Teratoid/Rhabdoid Tumor Microenvironment

　　

背景/目的：原始GSE283839研究描述了非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤（ATRT）中恶性细胞的异质性。基于这一资源，研究人员进一步探究了尚未充分表征的胶质细胞微环境，重点分析了星形胶质细胞和小胶质细胞的转录程序及其与肿瘤细胞之间由表达数据支持的候选相互作用。方法：研究人员利用已发表的注释信息、程序评分、配对星形胶质细胞-肿瘤比较以及保守的注释敏感性分析，对来自12例ATRT肿瘤的单核RNA测序（snRNA-seq）数据进行了重新分析。CellChat分析采用10,000次置换检验和模型内的Benjamini-Hochberg（BH）校正。独立验证队列包含来自4例患者的8份标本。结果：发现数据集包括47个已注释的星形胶质细胞和288个已注释的小胶质细胞。星形胶质细胞表达SLC1A2、SLC1A3和GLUL，在三例可评估肿瘤中的两例中，其谷氨酸/谷氨酰胺模块得分高于匹配的肿瘤细胞。这种差异在保守注释下唯一可评估的肿瘤中仍然存在。小胶质细胞表现出重叠的炎症、免疫调节、吞噬/脂质加工和抗原呈递程序。在12例肿瘤中，小胶质细胞的CD74表达与抗原呈递模块得分相关。候选相互作用包括星形胶质细胞到肿瘤的NCAM1–FGFR1和PTN–PTPRZ1，以及小胶质细胞到肿瘤的SPP1相关配对。肿瘤到小胶质细胞的APP–CD74在10例符合条件的发现队列肿瘤中的7例通过了模型内BH校正。外部验证分析支持在来自4例患者的5例可评估标本中，至少有一个髓系细胞群中存在肿瘤到髓系的APP–CD74信号。结论：这项探索性研究揭示了ATRT中星形胶质细胞的代谢表达程序和小胶质细胞的免疫相关程序，并优先推荐APP–CD74及其他由表达数据支持的胶质细胞-肿瘤相互作用候选分子用于未来的空间和功能研究。

研究背景与科学问题

非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤（Atypical Teratoid/Rhabdoid Tumor, ATRT）是一种主要发生于婴幼儿的高度侵袭性中枢神经系统恶性肿瘤，其特征是SWI/SNF染色质重塑复合物核心组分SMARCB1/INI1（或较少见的SMARCA4/BRG1）的功能缺失。尽管采取了多模式治疗，但由于发病年龄早、进展迅速以及强化治疗的毒性，该疾病在临床上仍极具挑战性。分子分型已将ATRT分为ATRT-MYC、ATRT-SHH和ATRT-TYR三个亚组，它们在表观遗传状态、转录程序、发育起源和临床关联上存在差异。然而，这些肿瘤内在的差异并不能完全解释肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）中非恶性细胞如何影响恶性细胞状态、治疗反应和疾病进展。此前关于ATRT微环境的研究虽已揭示了亚组依赖性的淋巴和髓系浸润、巨噬细胞-肿瘤效应、营养胁迫下的生态系统响应以及进展过程中的微环境变化，但针对非恶性细胞组分，尤其是星形胶质细胞和小胶质细胞的系统性转录谱分析仍十分匮乏。因此，有必要对已有的snRNA-seq数据进行深度挖掘，以阐明这些胶质细胞在ATRT微环境中的潜在功能和相互作用。

研究设计与核心发现

为填补上述空白，研究人员对公开发表的GSE283839数据集中的12例ATRT肿瘤进行了重新分析。该数据集原始研究聚焦于恶性细胞异质性，而本研究则专门针对其中占比极低的非恶性细胞组分——516个（2.94%）非恶性细胞核，其中小胶质细胞占55.81%（288个），星形胶质细胞占9.1%（47个）。研究旨在描述这些胶质细胞的转录程序，并通过配体-受体推断识别它们与肿瘤细胞间的候选相互作用。主要结论包括：星形胶质细胞尽管数量稀少，却是TME中一个异质性组分，一致性地表达了与谷氨酸-谷氨酰胺代谢相关的基因（如SLC1A3、SLC1A2、GLUL），并在部分肿瘤中显示出高于匹配肿瘤细胞的代谢模块得分；小胶质细胞则表现出多种重叠的转录程序，涵盖稳态、炎症、免疫调节、吞噬、抗原呈递及应激反应等。通过细胞间相互作用分析，研究优先筛选出星形胶质细胞-肿瘤之间的NCAM1-FGFR1和PTN-PTPRZ1通路，以及小胶质细胞-肿瘤之间的APP-CD74和SPP1相关通路作为候选。其中，APP-CD74在外部独立队列中也获得了一致支持，被确定为最值得优先进行功能性研究的候选分子。

关键技术方法概述

1. 1.
   数据来源与处理：研究使用了公开数据库GSE283839中的10X v3单核RNA测序（snRNA-seq）数据，包含12例ATRT肿瘤的17,564个细胞核。外部验证队列来自ScPCA项目（SCPCP000010），包含4例患者的8份配对标本。研究人员保留了原始研究中的恶性/非恶性分类和细胞注释作为基线。
2. 2.
   细胞注释与敏感性分析：对于非恶性细胞，除了使用已发表的注释外，还采用了基于复合标志物（如星形胶质细胞标志物ALDH1L1、AQP4、SLC1A2、SLC1A3；小胶质细胞标志物P2RY12、TMEM119、GPR34、SALL1）的保守注释策略，并结合竞争性谱系排除、富集分析和邻域支持，定义了更严格的细胞群体，以评估结果的稳健性。
3. 3.
   转录程序评分：分别对星形胶质细胞和小胶质细胞进行了程序评分。星形胶质细胞采用基于原始计数的秩次评分法，评估了稳态、泛反应性、炎症和细胞外基质重塑四个程序。小胶质细胞则基于ln(1+CP10K)标准化后的表达值，计算了九个预设程序（如稳态、炎症相关、免疫调节相关、吞噬/脂质相关、抗原呈递相关等）的平均z-score。
4. 4.
   配体-受体相互作用推断：使用CellChat 2.1.2软件，基于其内置的人类数据库，对分泌性信号、细胞-细胞接触和细胞外基质-受体相互作用进行推断。所有模型均采用10,000次置换检验和模型内的Benjamini-Hochberg（BH）多重假设检验校正。

主要研究结果

3.1 ATRT肿瘤微环境的细胞景观

基于已发表注释，在17,564个细胞核中，17,048个（97.06%）被归为肿瘤区室，仅516个（2.94%）为非恶性TME细胞。TME中最大的群体是源标记的小胶质细胞（288个，55.81%），其次为少突胶质前体细胞（OPC）、内皮细胞、星形胶质细胞（47个，9.1%）、神经元和周细胞。不同样本间非恶性细胞比例差异巨大（中位数3.33%，范围1.32%-87.25%），其中ATRT-MYC-2样本的非恶性细胞比例异常高（89/102）。

3.2 星形胶质细胞表现出重叠且样本可变的程序状态

通过对47个星形胶质细胞进行程序评分，研究发现这些细胞呈现出异质性的转录状态。在设定的阈值下，25.5%的细胞阳性于稳态程序，19.1%阳性于泛反应性程序，10.6%阳性于炎症程序，12.8%阳性于ECM重塑程序。各程序之间存在显著重叠，近半数细胞（48.9%）未达到任何程序的阳性阈值。这表明星形胶质细胞并非处于单一的功能状态。

3.3 供体特异性星形胶质细胞表达与配体-受体候选

对含有≥5个星形胶质细胞的3个肿瘤进行配对伪批量分析显示，谷氨酸/谷氨酰胺模块在星形胶质细胞中的中位表达高于匹配的肿瘤细胞（中位差+1.294 log2(CPM+1)），但这种差异在不同肿瘤间并不一致（TYR-2和MYC-3为正，SHH-4为负）。单个基因层面，SLC1A3、SLC1A2和GLUL在星形胶质细胞中广泛检测到，且表达水平高于肿瘤细胞。在初始的CellChat分析中，NCAM1-FGFR1和PTN-PTPRZ1被列为星形胶质细胞向肿瘤细胞通信概率最高的候选通路。

3.4 重叠的源标记小胶质细胞转录程序

在288个源标记小胶质细胞中，炎症相关和免疫调节相关得分呈连续分布，两者之间存在弱正相关（Spearman rho=0.215），表明这些程序可以共存。各程序在细胞水平上高度重叠，没有一个程序占据绝对主导地位。在样本水平上，未检测到任何小胶质细胞程序得分在三个ATRT分子亚型之间存在显著差异（所有校正后p≥0.66）。

3.5 候选小胶质细胞-肿瘤配体-受体关联

新的CellChat分析提名了小胶质细胞向肿瘤的SPP1相关通路和肿瘤向小胶质细胞的APP-CD74通路。其中，APP-CD74在所有三个亚型的模型中均通过了模型内BH校正。在供体水平的分析中，APP-CD74在10例符合条件的肿瘤中的7例也通过了BH校正，显示出较高的一致性。相关性分析表明，小胶质细胞中CD74的表达水平与抗原呈递模块得分强相关（Spearman rho=0.923）。

3.6 保守注释限制了源标记胶质细胞的恢复

通过保守的标记物标准，仅有23/47个源标记星形胶质细胞和15个微胶质细胞富集群得到确认，同时鉴定出大量巨噬细胞样、边界相关巨噬细胞样（BAM-like）和未解决的髓系细胞。这表明源标记的“小胶质细胞”类别实际上包含了多种髓系细胞状态。保守注释导致配对伪批量分析仅剩一例可评估肿瘤，削弱了先前观察到的星形胶质细胞代谢模块差异的普遍性。

3.7 外部队列比较

在外部ScPCA队列中，保守注释未能鉴定出任何符合标准的星形胶质细胞，因此无法验证星形胶质细胞相关发现。在髓系细胞中，肿瘤向髓系的APP-CD74信号在5/5例可评估标本（来自4/4例患者）中通过了BH校正，为该候选通路的普适性提供了额外支持。然而，由于外部队列样本量小且主要为复发标本，无法对发现队列中的CD74与抗原呈递的相关性进行统计学确认。

讨论与结论总结

讨论部分总结：本项再分析工作描述了一个规模很小的非恶性细胞区室中的胶质细胞表达程序。研究强调，源标记的小胶质细胞类别不能等同于驻留小胶质细胞，其中混杂了多种髓系细胞状态。星形胶质细胞表达的SLC1A2、SLC1A3和GLUL支持其在TME中可能参与谷氨酸-谷氨酰胺代谢的假说，但这仅为表达层面的推论，并未证实实际的代谢通量。星形胶质细胞-肿瘤的候选相互作用（如NCAM1-FGFR1）和肿瘤-小胶质细胞的候选相互作用（如APP-CD74）在多个分析中表现出一致性，但均需后续实验验证。研究特别指出，许多结果在更严格的保守注释条件下失去了统计支持，这凸显了当前小样本量的局限性，并明确了未来需要加大采样力度的方向。

结论部分翻译：这项探索性研究突出了ATRT中星形胶质细胞的代谢表达程序和小胶质细胞的免疫相关程序，并优先推荐APP-CD74及其他由表达数据支持的胶质细胞-肿瘤相互作用候选分子用于未来的空间和功能研究。