《Cancers》：Identification of Candidate Partner Cells in Tumor–Stromal Interactions by Histology-Based Spatial Analysis for Prognostic Stratification After Neoadjuvant Chemotherapy
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尽管多学科治疗取得了进展，复发仍是难治性癌症面临的主要临床挑战。许多患者在新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapy, NAC）后存在残留肿瘤，而未达到病理学完全缓解（pathological complete response, non-p
尽管多学科治疗取得了进展，复发仍是难治性癌症面临的主要临床挑战。许多患者在新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapy, NAC）后存在残留肿瘤，而未达到病理学完全缓解（pathological complete response, non-pCR）患者的临床结局具有异质性。残留肿瘤细胞与周围间质细胞之间的空间关系可能为进一步的预后分层提供信息。在本综述中，研究人员讨论了基于手术标本的组织学空间分析（histology-based spatial analysis, HSA），重点关注胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）。研究人员描述了连接现有生物学、组织学和临床发现的四个步骤：首先，比较细胞间距离和局部细胞数量以识别候选配对细胞；其次，通过功能性和分子学研究探讨其与肿瘤细胞的相互作用，包括对生存和耐药性的影响；第三，对免疫染色的患者标本进行HSA，测量包含经上述研究支持的细胞关系的病灶数量、大小和定位；第四，将这些测量结果与复发和生存情况以及已确立的临床病理因素一起进行评估。该方法利用存档的手术标本将生物学发现与患者结局联系起来。其在NAC后预后分层中的价值需要在大型临床队列中进行验证。
1. 引言
新辅助化疗（NAC）用于多种实体瘤，其疗效通常通过术后切除标本的组织病理学评估来判断。病理学反应根据残留肿瘤的存在和程度进行分类，包括病理学完全缓解（pCR）和非pCR（non-pCR）。不同癌症类型中达到pCR的比例差异显著。在乳腺癌中，三阴性患者接受NAC联合曲妥珠单抗治疗后pCR率可达33.6%，而激素受体阴性、HER2阳性患者可达50.3%。在NAC方案中加入帕妥珠单抗可进一步提高HER2阳性疾病的pCR率。相比之下，胰腺导管腺癌（PDAC）在新辅助治疗后病理学完全缓解并不常见，大多数切除标本含有残留肿瘤。non-pCR病例在各肿瘤类型中仍存在显著的复发风险，包括乳腺癌和胰腺癌。由于相当比例的患者在NAC后为non-pCR疾病且其临床结局具有异质性，因此在该人群中进行进一步的预后分层具有重要的临床意义。残留肿瘤组织由生物学异质性的细胞群体组成，这些细胞并非随机分布，而是在残留肿瘤微环境中具有空间组织性。例如，在PDAC中，功能不同的癌症相关成纤维细胞（CAF）群体相对于肿瘤细胞呈现不同的分布模式。这些观察结果表明，NAC后的残留肿瘤代表了由存活肿瘤细胞和间质成分共同构成的空间组织化的肿瘤微环境（TME）。TME的空间组织也与多种癌症的临床结局相关。这些发现支持探究NAC后残留肿瘤中的空间信息是否可用于进一步的预后分层。分子病理标志物和组学分析已表征了肿瘤细胞的分子和遗传特征，并为精准医学的发展做出了重要贡献。然而，传统的分子病理评估主要侧重于肿瘤细胞内在特征，而对涉及周围间质成分的空间信息的整合较少。这一局限性具有临床相关性，因为具有相似组织学或分子谱的肿瘤可能表现出截然不同的治疗反应和临床病程。越来越多的证据表明，肿瘤侵袭、治疗抵抗和预后不仅受肿瘤细胞内在特征的影响，还受到与间质成分（包括CAF、免疫细胞和细胞外基质（ECM））相互作用的影响。在NAC后的残留肿瘤中，间质成分与治疗反应和复发风险相关。然而，批量组学需要组织匀浆化处理。单标记免疫组化（IHC）保留了空间信息，但区分多种表型定义的细胞群体的能力有限，因此难以直接评估它们的空间关系。因此，肿瘤细胞与周围间质细胞群体之间的空间关系代表了组织信息的一个额外维度，而常规以肿瘤细胞为中心的评估未能充分捕捉这一信息。空间分析可以通过定量评估定义的目标细胞与周围间质细胞之间的关系来弥补这一不足。通过比较细胞间距离和局部细胞丰度，显示出与目标细胞具有优先空间关系的细胞群体可被识别为候选配对细胞。为了识别与生物学相关且与患者预后相关的肿瘤-间质细胞空间关系，需要整合空间、功能和临床信息。近年来空间生物学的进展为研究TME的空间组织提供了多种技术。高多重空间平台，包括多重免疫组化（mIHC）、成像质谱流式（IMC）、CODEX和空间转录组学（ST），能够在保留组织内精确空间组织的同时，同时可视化多个分子标记或基因表达谱。这些技术使得能够详细表征TME内的细胞组成和空间组织，并扩展了对肿瘤-间质关系的分析。近期研究从几个互补的角度探讨了TME的空间组织，包括关注肿瘤与免疫细胞空间关系的邻域分析、多细胞群体空间组织的分析，以及基于人工智能（AI）的常规组织学图像空间分析。这些进展共同为将组织学空间分析作为一种实用方法来评估常规组织切片中的空间关系奠定了基础。Li等人根据来自457例非小细胞肺癌患者的41重CODEX数据中肿瘤、免疫和间质细胞的排列定义了10种细胞邻域类型。他们开发了CANVAS方法，用以从苏木精-伊红（H&E）染色图像中推断相应的空间组织，并将其应用于跨越九种癌症类型的超过5000名患者，检查了与预后和免疫治疗后结局的关联。本综述探讨了利用手术标本的组织学空间分析来识别候选配对细胞、评估其空间关系的生物学相关性，并支持NAC后预后评估的潜力。
2. 难治性癌症中的肿瘤-间质相互作用
2.1 肿瘤进展部位肿瘤细胞与间质细胞的空间关联
结直肠癌的组织病理学研究显示，浸润前沿比浅表肿瘤区域具有更具侵袭性的特征。例如，Kawamura等人报告了20例结直肠癌病例中TOPO1阳性率随深度递减的情况，作者讨论了低TOPO1表达可能与伊立替康耐药有关。这说明了可能与药物耐药相关的区域性表型差异。在转移进展过程中，早期病变最初主要由增殖的肿瘤细胞组成。随着病变生长，肿瘤衍生的血管生成因子诱导来自周围宿主组织的新血管形成。实验和临床病理学研究已描述了这一过程。肿瘤细胞和间质细胞常在浸润前沿和周边区域发现紧密的空间关联。肿瘤细胞的增殖活性和表型在同一肿瘤内存在差异，与周围间质细胞的相互作用可能导致这些差异。因此，可以通过将区域肿瘤细胞特性与周围间质细胞的空间分布相关联来研究瘤内异质性。
2.2 PDAC中肿瘤-间质相互作用的临床和生物学相关性
PDAC是一种难治性癌症。以治愈为目的的治疗在很大程度上仍然依赖于手术切除，即使结合化疗和放疗的多学科治疗也仅使患者生存期获得适度改善。新辅助化疗（NAC）越来越多地用于可切除和交界性可切除PDAC患者。PDAC在新辅助治疗后病理学完全缓解并不常见，大多数切除标本含有残留肿瘤。non-pCR患者仍有早期复发或远处转移的风险。致密的结缔组织增生性间质围绕肿瘤细胞是PDAC的特征性组织学表现。癌症相关成纤维细胞（CAF）是该结缔组织增生性间质的主要细胞成分。CAF常靠近胰腺癌细胞，提示存在肿瘤-间质相互作用的可能性。在切除的PDAC中，较高的活化间质指数与较差的生存率独立相关。不同CAF亚群可能与预后有不同的关联。结缔组织增生性间质也与转移灶的进展有关，并且CAF标志物的表达模式与切除后的总生存期相关。这些研究表明，CAF相关结缔组织增生性间质的丰度和组成可能为PDAC患者提供预后信息。实验研究表明，CAF影响胰腺癌细胞的恶性特性。在实验模型中，来自CAF和胰腺星状细胞的IL-6支持胰腺癌细胞存活并促进侵袭。胰腺星状细胞还能诱导上皮-间充质转化（EMT）并增加共培养的胰腺癌细胞的迁移能力。此外，实验证明CAF通过分泌因子和外泌体促进胰腺癌细胞的化疗耐药，导致对抗癌药物的敏感性降低。肿瘤细胞分泌的因子可以改变间质细胞的表型。?hlund等人证明，胰腺癌类器官的条件培养基增加了CAF中IL-6的表达，并降低了编码αSMA的Acta2的表达。这表明肿瘤衍生因子对CAF基因表达和特性的影响。如上所述，肿瘤细胞与间质细胞之间的紧密空间关联在实体瘤（包括结直肠癌）的浸润前沿和周边区域经常观察到，提示肿瘤-间质相互作用在这些区域观察到的侵袭性特征中可能发挥作用。总之，上述组织病理学、临床和实验研究结果支持PDAC-CAF相互作用参与PDAC恶性行为的观点。更广泛地说，肿瘤-间质相互作用与各种难治性癌症的预后相关。因此，对手术标本中肿瘤细胞与间质细胞之间空间关系的定量评估可能为NAC后的预后评估提供相关信息。
3. 通过组织学空间分析识别候选配对细胞
3.1 目标细胞与候选配对细胞之间空间关系的定量评估
介质的量取决于产生介质的细胞丰度，而其作用的空间范围则取决于与这些细胞的距离。例如，膜结合的RANKL通过与受体RANK直接结合传递信号。在这种情况下，更多的RANKL产生细胞可能导致更强的信号传导。因此，肿瘤-间质相互作用的强度可能至少部分取决于所涉及的细胞数量。某些细胞群体，如调节性T细胞（Tregs），即使在数量很少的情况下也具有重要的生物学作用。因此，细胞数量本身并不能决定一个群体的重要性。在其他条件（包括单个细胞功能）保持不变的情况下，细胞数量可能通过局部提供的因子量和与目标细胞接触的机会来影响相互作用的强度。这支持将细胞数量的量化与细胞间距离的测量结合起来。可溶性RANKL通过蛋白水解裂解产生，可以作用于位于RANKL产生细胞远处的表达RANK的细胞。因此，膜结合形式和可溶性形式的作用空间范围不同。对于可溶性因子，应答细胞的暴露取决于浓度以及该因子是否能到达它。Francis和Palsson模拟了单个分泌细胞的扩散。他们的模型将浓度分布和有效信号传导范围与分泌和扩散联系起来。在其他条件不变的情况下，该模型预测浓度随距离增加而降低，并且维持响应所需浓度的范围有限。Kopesky等人提供了一个浓度依赖性反应的实验实例。他们培养了人破骨细胞前体细胞，加入M-CSF并改变RANKL的添加浓度。破骨细胞数量在0-66 ng/mL RANKL范围内增加，在更高浓度下不再进一步增加。因此，反应依赖于RANKL的浓度而非其存在与否。综上所述，这些理论和实验发现表明，即使可溶性因子在远处起作用，产生细胞与应答细胞之间的距离也可能通过局部浓度影响反应。因此，测量距离以及介质产生细胞的数量可以为细胞相互作用的研究提供信息。Carstens等人研究了来自132例未接受新辅助治疗的PDAC患者的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织微阵列（TMA）。多重免疫荧光鉴定了肿瘤细胞和T细胞群体。使用Ripley's L函数评估T细胞相对于肿瘤细胞核中心的分布。在0-20 μm范围内L函数曲线下的面积衡量了肿瘤细胞附近的浸润程度。在此范围内更大的细胞毒性T细胞浸润与更长的总生存期相关。Saltz等人使用深度学习在来自癌症基因组图谱（TCGA）中13种癌症类型4759名患者的5202张H&E全切片图像上绘制了肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）。图像被划分为50×50 μm的斑块。TIL空间分数是TIL阳性斑块数除以含组织斑块总数，而非单个淋巴细胞的数量。空间分布和聚类在不同癌症类型、免疫亚型和肿瘤分子亚型之间存在差异。目标细胞与候选配对细胞之间的距离也被量化。将距离与局部细胞数量相结合可以表征它们的空间关系。在结直肠癌肿瘤出芽区域，研究人员检查了CAF和巨噬细胞作为潜在的配对细胞群体。在这项研究中，研究人员专注于巨噬细胞作为候选配对细胞，并定量评估了它们与肿瘤细胞的数量和距离。Kawamura等人通过将同一区域的巨噬细胞计数除以肿瘤细胞计数来计算每个肿瘤细胞的巨噬细胞数量。他们测量了肿瘤细胞-巨噬细胞距离，并绘制了距离区间内的巨噬细胞计数。为了进行区域比较，他们在无肿瘤出芽的浸润前沿和肿瘤出芽区域选择了1 mm2的区域。在使用HALO的HSA中，用不同免疫组化标记染色的连续切片被数字化，并在每张切片中检测感兴趣细胞的位置。图像被配准，细胞位置在一个共同的坐标系中叠加。然后可以在该共享平面上测量距离和局部细胞数量，而不是在每个染色中单独计数阳性细胞。例如，Suzuki等人将PD-L1阳性细胞和泛角蛋白阳性肿瘤细胞叠加在一个坐标图上。他们测量了每个PD-L1阳性细胞到最近肿瘤细胞的距离，以及分析区域内每个肿瘤细胞周围的PD-L1阳性细胞数量。Carstens等人选择了20 μm的范围来检查细胞接触可能发生的区域。这个范围不是一个通用的阈值。根据问题的不同，候选识别可以跨距离区间比较细胞分布，或者在指定范围内计数细胞。对应于NAC后残留肿瘤中生物学发现或预后的距离范围需要进一步研究。对于NAC后标本，应使用预先定义的组织学和免疫组化标准来识别存活的残留肿瘤细胞和感兴趣的间质群体。应在分析前定义感兴趣区域（ROI）。测量指标包括到最近候选细胞的距离以及在每个肿瘤细胞指定半径内的候选细胞数量。这些测量结果应结合局部细胞密度和组织结构来解释，后者可能在没有特定关联的情况下产生表面上的接近性。空间邻近性本身并不能建立功能性相互作用；它选择候选者进行分子和功能评估。在本综述中，配对细胞是指以生物学相关方式与肿瘤细胞相互作用的细胞。候选配对细胞需要进一步验证其相互作用的性质和生物学相关性，才能被视为配对细胞。它们的作用可能是促肿瘤或抑肿瘤的。对于这些分析，应在H&E染色切片上定位存活的残留肿瘤，ROI应包括周围感兴趣的间质细胞。排除坏死区域。没有残留肿瘤细胞的纯纤维化区域不被选择，但当含有正在研究的细胞群体时，存活肿瘤周围的纤维性间质应予以保留。H&E切片应与用于分析的免疫染色切片匹配。ROI边界和排除区域应记录在图像上。应在结果分析前指定选择和排除标准，并检验其可重复性。切片选择和切片内的ROI选择是独立的决策。Carstens等人审查了未经治疗的PDAC的H&E切片，为每位患者选择了两个代表性的1毫米直径肿瘤核心用于TMA，并分析了5 μm厚的切片。Saltz等人使用了来自TCGA的诊断性H&E全切片图像，当一位患者有多个诊断性切片可用时，使用指定为DX1的切片进行关联分析。NAC后研究需要指定采样部位、切片数量、ROI的位置、面积和数量，以及在分析结果前如何汇总每位患者的测量值。二维切片代表所分析的区域，可能无法显示病灶在提交器官内的集中位置。当病灶数量和大小用作患者水平的测量值时，应记录每张切片的宏观采样位置。这使得可以研究病灶在器官内的分布，以及所选切片代表整个器官的程度。
3.2 通过比较空间分析识别候选配对细胞
候选配对细胞群体内的亚群不一定以相同的方式与目标细胞相互作用。例如，巨噬细胞群体可以表现出不同的激活状态，历史上通过M1/M2框架描述，在TME中具有不同的功能。邻近性分析可以量化每个亚群与目标细胞的空间关系。因此，研究人员认为比较这些空间关系可以识别出与目标细胞表现出优先空间关联的亚群，将其作为候选配对细胞。类似地，比较多种候选细胞类型与目标细胞的空间关系可以识别出那些与目标细胞表现出优先空间关系的细胞类型。同样的比较也可以在不同的候选细胞类型之间进行。研究人员将这种方法应用于三阴性乳腺癌（TNBC）的边缘区域。研究人员发现PD-L1+间质细胞在边缘区域聚集，并且这些细胞中的大多数是CD68+巨噬细胞。相比之下，CD68+巨噬细胞在边缘区域和核心区域均呈弥漫性分布，因此CD68+巨噬细胞的总体分布不能解释PD-L1+间质细胞在边缘区域的优先积累。因此，研究人员关注了CD68+巨噬细胞群体中表达PD-L1的亚群。为了确定该亚群是否与TNBC细胞表现出特定的空间关系，研究人员测量了PD-L1+细胞到最近TNBC细胞的距离，并计算了每个TNBC细胞周围的PD-L1+细胞数量。这种空间分析表明，PD-L1+亚群，而非整个CD68+巨噬细胞群体，可能代表了TNBC细胞的候选配对细胞群体。在口腔鳞状细胞癌（OSCC）的下颌骨侵犯区域，组织学检查显示在OSCC和下颌骨之间有一个分层的间质区域，其中富含CAF。因此，研究人员聚焦于该间质区域内的CAF，并评估了它们与OSCC细胞和破骨细胞的邻近性。结果发现，大量CAF与OSCC细胞和破骨细胞都非常接近。这些发现提示CAF与OSCC细胞和破骨细胞之间的空间关系可能反映了它们各自的细胞相互作用。在这一层内，一个CAF群体靠近OSCC细胞，另一个靠近破骨细胞，表明它们与各自细胞类型具有不同的空间关系。这一观察结果使研究人员考虑到，邻近性分析可以区分形态学定义的间质群体内空间上不同的亚群，并为定义的目标细胞群体识别候选配对细胞。此外，如果能通过IHC或原位杂交（ISH）使用表型特异性标记来识别特定的间质细胞亚群，那么就可以通过邻近性分析来识别该亚群的候选配对细胞。总之，细胞间距离和局部细胞数量可以通过比较群体和亚群的空间分布来识别候选配对细胞。这些比较有助于确定哪些间质细胞群体值得研究与肿瘤细胞的相互作用，以及这些群体在组织内的位置。仅凭邻近性并不能确立生物学相关性。因此，需要体外及其他实验研究来确定所涉及的相互作用及其对肿瘤细胞特性的影响。
4. 肿瘤-间质空间关系的生物学和临床相关性
4.1 NACT后PDAC中与预后相关的区域
空间分析可以识别候选配对细胞，但其在NAC后残留PDAC中的额外预后价值仍有待确定。接下来的部分将探讨生物学发现如何指导患者组织中病灶的测量及其后续的临床评估。大多数切除的PDAC标本在新辅助治疗后含有残留肿瘤，non-pCR患者仍有高复发风险。区分该组内的结局是一个重要的临床问题。Okubo等人利用NAC后PDAC手术标本的H&E染色切片研究了与预后相关的组织学特征。他们定义了残留肿瘤面积（ART）为多个存活残留肿瘤区域所占面积的总和，并证明ART是NAC后PDAC无复发生存期（RFS）的独立预测因子。这些发现表明，在常规H&E染色切片中识别的存活残留肿瘤区域代表了与NAC后预后评估相关的组织学区域。他们数字化了包含残留肿瘤的最大横截面的H&E切片，并勾勒出存活肿瘤区域。排除了坏死肿瘤细胞、纤维化、原位病变和无细胞粘液池。距离最大肿瘤区域超过2 mm的存活病灶被单独测量，其面积相加得到ART。临床验证应包括接受新辅助化疗后切除的残留PDAC患者。在分析结果之前，研究者应指定识别候选CAF群体的标准、待检查的区域、如何汇总每位患者病灶数量、大小和定位的测量值，以及主要终点（如RFS）。还应预先指定临床病理变量，并将病理分期、ART、病理治疗反应和淋巴结状态视为候选变量。然后可以使用多变量Cox回归来检验在考虑了所选因素后，病灶数量和大小是否与结局相关。需要评估超出这些因素的额外预后价值，并且研究结果需要在独立队列中进行验证。染色、图像分析和ROI选择的变异性也需要评估。
4.2 肿瘤细胞与CAF之间空间关系的生物学相关性
CAF促进胰腺癌的侵袭性。鉴于在胰腺癌组织学中观察到的显著结缔组织增生反应，CAF是与肿瘤细胞相关的一个重要间质细胞群体。然而，肿瘤细胞与CAF之间的空间邻近性本身并不一定表明它们相互作用的生物学相关性。此外，已知CAF表现出多种表型。因此，可以利用邻近性分析来识别与肿瘤细胞表现出优先空间关系的CAF表型，将其作为候选配对细胞。在NAC后手术标本中，可以将功能证据与这些空间关系相结合，以评估候选肿瘤-间质相互作用的生物学相关性。如果唯一目的是确认CAF靠近肿瘤细胞，那么区分CAF表型的价值有限。相关的问题是，不同的表型是否与不同的生物学效应相关。比较它们与肿瘤细胞的距离和局部细胞数量可以确定哪种表型出现在哪些肿瘤细胞附近，以及数量多少。这为功能研究选择了候选配对细胞；每种相互作用的效应和生物学相关性仍需验证。报道的表型包括肌成纤维细胞样CAF（myCAF）、炎性CAF（iCAF）和抗原提呈CAF（apCAF），分别以αSMA、IL-6和MHC II类等标志物为特征。然而，单一标志物的表达本身并不能确定一个细胞属于特定的CAF表型。候选CAF群体应首先通过高维分析或多重标记分析进行表征。然后可以选择一个经过验证的较小标志物面板用于存档组织切片。在确认细胞识别和空间测量的可重复性后，邻近性分析可以评估这些由标志物定义的CAF群体与存活残留肿瘤细胞之间的关系。通过mRNA表达定义的CAF表型可以通过针对区分性转录本的ISH在切片中识别。下游信号分子的磷酸化也可能有助于识别响应肿瘤细胞分泌因子的CAF。一旦这些细胞识别方法得到验证，就可以测量与肿瘤细胞的距离和局部细胞数量来识别候选配对细胞。此类研究可能将邻近性分析扩展到更多的CAF群体。随后需要进行功能研究来确定候选CAF群体是否影响肿瘤细胞的存活、侵袭性或治疗抵抗。同样的方法可以应用于新发现的CAF亚群，前提是它们能在存档标本中被可靠识别，并且它们与残留肿瘤细胞的空间关系能被可重复测量。这些新发现的亚群需要像已建立的CAF表型一样进行评估，以确定它们是否可以作为候选配对细胞，它们与肿瘤细胞的相互作用是否具有生物学相关性，以及包含这些相互作用的区域是否与患者预后相关。邻近性分析可用于量化新发现的CAF亚群与肿瘤细胞之间的空间关系。基于这些空间关系，可以识别可能作为候选配对细胞的CAF亚群。NAC后的纤维化、坏死、无细胞粘液和炎症会改变组织结构、细胞密度和细胞间距离。在这种组织中，邻近性本身并不能确定一个与预后相关的病灶。所提出的四步法将基于HSA的候选识别、生物学分析、患者组织中相应病灶的检查以及临床评估分开。在第三步中，对免疫染色切片进行HSA，将残留肿瘤细胞与基于生物学证据（如对存活或耐药性的影响）被视为配对细胞的间质群体一起检查。测量患者组织中包含相应细胞关系的病灶的数量、大小和定位。图中的焦点A表示基于第二步生物学发现选择的病灶，并不表示与患者预后有确定的关联。第三步还检查了病灶在提交器官内的三维定位和分布。未来的研究需要对整个提交器官进行取样，制备组织切片，并记录每张切片的宏观采样位置。然后HSA可以检查病灶出现的位置以及它们的数量和大小在不同区域间的差异。这些分布可以为切片和ROI的选择提供信息。需要进一步的工作来确定有限的一组切片能在多大程度上代表病灶的器官水平分布。在第四步中，每位患者的病灶测量值与NAC后的复发和生存相关联。其预后价值需要在大型临床队列中进行评估。因此，HSA有两个不同的目的：在生物学分析之前选择候选细胞群体，以及之后测量患者组织中的相应病灶。后者的测量将生物学发现与临床评估联系起来。
4.3 在大规模队列中对空间关系进行临床验证
四步法使用了互补的空间方法。详细的细胞表征可以指导为生物学研究选择群体，而对存档切片的HSA可以测量相应的病灶，以便随后在non-pCR PDAC中进行临床评估。高多重平台包括mIHC和多重免疫荧光（mIF）、IMC、CODEX和ST。这些平台能够对TME进行详细的分子作图，有助于识别以前未被认识的亚群并研究其分子特征。相比之下，它们在大型回顾性队列中的应用受到成本、专门仪器和标本要求的限制。基于常规组织学标本的邻近性分析与这些高多重平台各有优劣。对常规H&E或单标记IHC切片的邻近性分析可以测量通过这些染色可识别的细胞群体的距离和分布。特定的CAF亚群很难通过这种方式识别。它们的区分性标志物以及通过IHC或ISH进行的识别需要在邻近性分析前进行验证。来自常规病理学的存档材料允许在大型回顾性队列中评估这些测量值。因此，高多重表征和基于HSA的病灶测量可以支持生物学和临床研究的不同部分。总之，先前的研究描述了不同的CAF表型以及残留肿瘤中的组织学发现与患者预后之间的关联。需要进行生物学研究来检查候选CAF群体如何影响肿瘤细胞。对免疫染色切片进行HSA可以识别包含这些研究所支持的细胞关系的病灶，并测量其数量、大小和定位。利用存档的手术标本，这些测量值可以与大型临床队列中的复发和生存相关联。需要进一步的研究来确定它们是否能提供超越NAC后已确立的临床病理因素的额外预后信息。
5. 结论与未来方向
本综述探讨了基于手术标本的组织学空间分析支持NAC后预后评估的潜力。临床应用取决于四个相互关联的步骤：识别候选配对细胞，表征其与肿瘤细胞相互作用的生物学效应和机制，检查患者标本中相应病灶的数量、大小和定位，以及验证这些测量值的预后相关性。
5.1 候选空间相互作用的机制表征
邻近性分析可以识别可能与定义的目标群体相互作用的候选细胞群体。将这些候选细胞与目标细胞群体之间的空间关系与空间转录组学或蛋白质组学数据相结合，可能有助于阐明其潜在相互作用的分子基础和生物学意义。
5.2 用于患者分层的临床验证和预后建模
在大型回顾性队列中，从存档标本中获得的关于病灶数量、大小和定位的HSA衍生测量值可以与长期临床结局相关联，以评估相应肿瘤-间质相互作用的预后相关性。得到生物学和临床证据支持的空间相互作用可以为患者分层和预后模型的开发提供信息。
5.3 结论
基于组织学的空间分析提供了一个循序渐进的框架，用于识别候选配对细胞、评估其空间关系的生物学相关性、量化患者标本中的相应病灶，以及评估这些测量值与临床结局之间的关联。将该框架应用于已知结局患者的手术标本，可能有助于NAC后的预后分层。通过将源自手术标本的分子和功能发现与获取这些标本的患者的临床结局数据联系起来，基于组织学的空间分析可能在NAC后的机制研究和预后评估之间架起桥梁。
