非靶向代谢组学揭示植物乳杆菌发酵苹果汁的代谢重塑

《Microorganisms》：Untargeted Metabolomics Reveals the Metabolic Consequences of Lactobacillus plantarum Fermentation on Apple Juice

　　

乳酸菌（Lactic acid bacteria, LAB）发酵被广泛用于改善水果制品的风味、稳定性和生物活性。然而，LAB发酵对苹果汁的整体代谢后果及潜在的代谢物水平变化仍缺乏明确界定。本研究采用非靶向超高效液相色谱-质谱联用（ultra-high-performance liquid chromatography-mass spectrometry, UHPLC-MS）代谢组学结合多元分析，比较了苹果汁在植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）发酵前（unfermented apple juice, UFAJ）和发酵24小时（fermented apple juice, FAJ）后的差异。在检测到的974种代谢物中，有219种为差异代谢物（VIP > 1, p < 0.05），其中169种上调，50种下调，主要涉及苯丙素类和聚酮类、脂质、有机杂环化合物及有机酸。发酵富集了一系列功能性成分——4-三甲基铵丁酸（4-trimethylammoniobutanoic acid）增加幅度最大，秦皮素（fraxetin）显著保留，黄酮类化合物金圣草黄素（chrysoeriol）和三叶素（tricetin）、次黄嘌呤（hypoxanthine）及亚叶酸（folinic acid）上调——而肌醇半乳糖苷（galactinol）及若干糖基化前体下降。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）分析鉴定出55条显著富集的通路（p < 0.05），以核苷酸代谢、ABC转运蛋白、苯丙氨酸和嘌呤代谢以及C5-支链二元酸代谢为主。总体而言，发酵与苹果汁中代谢物丰度的显著变化相关，并相对富集了若干生物活性代谢物，为功能性发酵苹果汁提供了代谢组学基础。

苹果（Malus domestica L.）是全球消费量第二大的水果，富含膳食纤维、果糖、维生素（特别是C和E）、矿物质及酚类化合物，这些生物活性成分有助于缓解氧化应激和炎症。乳酸菌（LAB）发酵广泛应用于改善水果制品的风味、稳定性和生物活性，但LAB发酵对苹果汁的整体代谢后果及代谢物水平变化仍缺乏系统性认识。为此，研究人员采用非靶向UHPLC-MS代谢组学比较植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）发酵前后苹果汁的代谢差异，旨在鉴定差异代谢物及关联通路，为功能性发酵苹果汁的开发提供代谢组学基础。

研究人员选用红富士苹果（购自新疆石河子当地市场）和植物乳杆菌LP-600（购自上海鲜农生物技术）。苹果榨汁后添加0.1%抗坏血酸，经85°C灭菌15分钟，接种0.07%的植物乳杆菌LP-600（初始活菌数约10⁷ CFU/mL），于37°C发酵24小时，在0和24小时各采集三份样品。采用超高效液相色谱-质谱联用（UHPLC-MS）在正负离子模式下检测，使用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱，并定期插入质控样品。数据通过主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）处理，差异代谢物筛选标准为变量投影重要性（VIP）> 1且p < 0.05。

研究结果如下：

3.1 FAJ和UFAJ中代谢物的类型、分类及差异代谢物

维恩图分析显示共检测到974种代谢物，FAJ含973种、UFAJ含955种，共享954种。FAJ特有19种代谢物，包括4-三甲基铵丁酸、clitocine和乙基没食子酸；UFAJ仅特有去氧胆酸。727种代谢物经人类代谢组数据库（HMDB）注释分为十类，其中以苯丙素类和聚酮类（180种，24.76%）最多，其次为脂质（132种）、有机氧化合物（115种）、有机酸及其衍生物（106种）和有机杂环化合物（79种）等。按植物化学分类，初级代谢物中碳水化合物及其衍生物（71种）最多，其次为脂质（68种）、氨基酸及其衍生物（58种）、核苷酸及其衍生物（18种）和维生素（2种）。

3.2 FAJ和UFAJ非挥发性化合物的PCA和PLS-DA

主成分分析（PCA）显示FAJ与UFAJ明显分离，PC1和PC2的解释方差分别为66.90%和10.70%。偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）同样显示两组在监督投影空间中显著分离，模型拟合参数R2X、R2Y和Q2表明模型稳定。由于每组仅3个样本，PLS-DA仅用于探索性VIP筛选，差异代谢物以单变量统计（VIP > 1且p < 0.05）判定。

3.3 FAJ和UFAJ差异代谢物分析

以p < 0.05、差异倍数和VIP > 1为标准，共筛选出219种差异代谢物，包括42种苯丙素类和聚酮类、33种脂质和类脂分子、23种有机杂环化合物、21种有机酸及其衍生物、20种有机氧化合物等。火山图显示169种代谢物上调，50种下调。上调最显著的为4-三甲基铵丁酸，下调最显著的为1-(β-D-呋喃核糖基)-1,4-二氢烟酰胺。此外，秦皮素在FAJ中显著保留。

3.3.1 苯丙素类和聚酮类代谢

该类为最大差异类别，共42种，其中33种上调、9种下调。主要亚类包括黄酮类（19种）、香豆素及其衍生物（6种）、苯丙酸（5种）和肉桂酸及其衍生物（5种）。黄酮类中的金圣草黄素和三叶素显著增加，而apigenin 7-O-(6″-丙二酰芹菜素-葡萄糖苷)、山奈酚-3-α-L-阿拉伯呋喃糖苷和violanthin显著下降。发酵驱动的黄酮类富集与先前报道的L. plantarum发酵苹果汁提高DPPH和ABTS自由基清除活性一致。

3.3.2 脂质和脂质样分子代谢

共33种差异代谢物，29种上调、4种下调。脂质类别包括脂肪酰基（19种）、甘油磷脂（13种）等。4-三甲基铵丁酸、2-乙基-2-羟基丁酸、姜糖脂B和LPC 18:1显著增加；3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）、levomenol、肌醇半乳糖苷和veranisatin C显著下降。肌醇半乳糖苷下降可减少低聚糖生物合成，从而增强FAJ的消化性。

3.3.3 有机杂环化合物代谢

共23种差异代谢物，16种上调、7种下调。次黄嘌呤、7-羟基-6-甲基-8-核糖基二氧蝶呤、erinapyrone C和亚叶酸显著增加；7-甲基鸟嘌呤、胞嘧啶和咪唑丙酸显著下降。

3.3.4 有机酸及其衍生物代谢

共21种差异代谢物，14种上调、7种下调。氨甲环酸、烟酰甘氨酸、γ-谷氨酰亮氨酸（Gamma-Glu-Leu）和2-O-阿魏酰羟基柠檬酸显著增加；L-2-羟基戊二酸、藤黄酸、N-乙酰-L-谷氨酸和硫啡肽显著下降。

3.4 KEGG代谢通路分析

差异代谢物经KEGG数据库注释，涉及细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理和代谢四大类共13条通路。富集分析显示55条通路显著富集（p < 0.05），排名靠前的包括核苷酸代谢、ABC转运蛋白、苯丙氨酸代谢、嘌呤代谢和C5-支链二元酸代谢。代谢物-通路关联网络显示，差异代谢物主要富集于核苷酸代谢、氨基酸代谢、植物次生代谢物生物合成、脂质代谢和ABC转运系统。

讨论部分指出，发酵显著改变了苹果汁的代谢物组成，并相对富集了多种具有抗氧化或抗炎活性的代谢物，如黄酮类、次黄嘌呤和亚叶酸等。这些发现为理解LAB发酵苹果汁的品质形成和功能特性提供了代谢组学证据，并为后续开发功能性发酵苹果汁奠定基础。研究结论为：非靶向UHPLC-MS代谢组学揭示，植物乳杆菌发酵24小时使苹果汁中219种代谢物发生显著变化，其中169种上调、50种下调，主要涉及苯丙素类和聚酮类、脂质、有机杂环和有机酸类。发酵富集了4-三甲基铵丁酸、秦皮素、金圣草黄素、三叶素、次黄嘌呤和亚叶酸，而肌醇半乳糖苷和1-(β-D-呋喃核糖基)-1,4-二氢烟酰胺下降。KEGG分析将差异代谢物主要归入核苷酸代谢、ABC转运蛋白、苯丙氨酸和嘌呤代谢以及C5-支链二元酸代谢（55条通路，p < 0.05）。这些发现表明发酵显著调节苹果汁的代谢物组成，为发酵苹果汁的质量形成和功能开发提供了代谢组学基础。未来需要扩大样本量并进行靶向定量验证，包括关键差异代谢物的定量及其与功能和抗氧化指标的相关性，以全面验证当前发现。