布基纳法索瓦加杜古集体餐饮场所即食餐中大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的微生物质量、毒力基因及抗菌药物耐药性研究

《Microorganisms》：Microbiological Quality, Virulence Genes, and Antimicrobial Resistance of Escherichia coli and Staphylococcus aureus Isolated from Ready-to-Eat Meals Served in Collective Catering Facilities in Ouagadougou, Burkina Faso

　　

本研究评估了布基纳法索瓦加杜古大学、医院周边及工业食堂供应的159份即食餐的微生物质量，并对分离的大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）菌株进行了毒力基因及抗菌药物耐药性（AMR）分析。采用聚合酶链式反应（PCR）检测基因，纸片扩散法测定药敏。根据适用于熟制即食菜肴的标准，70.4%和50.3%的餐食分别因凝固酶阳性葡萄球菌和大肠杆菌而不合格（依据英国健康保护署标准，38.4%的餐食因葡萄球菌不合格）。从44份餐食（27.7%）中分离到仅携带astA作为唯一毒力基因的大肠杆菌菌株（n=50），并从5份餐食中检出产肠毒素性大肠杆菌（ETEC，携带estIa）；未检出aggR和pic基因。经PCR检测（未测序），来自51份餐食的73株金黄色葡萄球菌携带表皮剥脱毒素A基因eta；所有菌株均未携带mecA或sea–see基因。多重耐药性（MDR）影响了76.0%的astA阳性大肠杆菌和73.9%的金黄色葡萄球菌菌株（排除推定表型后分别为68.0%和65.2%）。在大肠杆菌中，blaSHV（81.8%）、blaCTX-M?1群（27.3%）和blaTEM（25.5%）占主导地位。这些发现表明微生物控制不足，并有必要在整个食品链中开展抗菌药物耐药性监测。

一、研究背景与目的

食源性疾病是全球重大公共卫生挑战。世界卫生组织估计，受污染食品每年导致约6亿人患病和42万人死亡，其中非洲区域疾病负担最重，每年约9100万病例和13.7万例死亡主要由腹泻病原体引起。金黄色葡萄球菌和致泻性大肠杆菌是重要的细菌性食源性疾病病原体。抗菌药物耐药性的传播进一步加剧了这一风险，即食餐作为细菌及其耐药决定簇同时接触大量消费者的关键界面，其安全性尤为值得关注。然而，在撒哈拉以南非洲地区，集体餐饮的微生物监测十分有限。布基纳法索瓦加杜古的大学餐厅、医院周边食堂及工业区食堂每日为大量学生、患者家属、医护人员和员工供餐，但其微生物监控数据匮乏。此前虽有研究报道了街头食品中携带耐药基因的多重耐药沙门氏菌，但尚无研究对布基纳法索集体餐饮中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的毒力及耐药决定簇进行分子联合筛查。因此，本研究旨在：（1）评估瓦加杜古集体餐饮设施中即食餐的微生物质量；（2）筛查大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分离株中的毒力基因；（3）描述其表型抗菌药物耐药性，并针对大肠杆菌检测其获得性耐药基因携带情况，为布基纳法索的食品安全和抗菌药物耐药性监测政策提供基线数据。

二、研究方法概述

研究人员于2020年8月至2021年7月在布基纳法索瓦加杜古开展了一项前瞻性横断面研究，从三类集体餐饮场所（大学食堂、医院周边食堂和工业区食堂）共9个采样点采集了159份即食餐样本。每份餐食作为一个独立样本单元，无菌采集300–500克或毫升后冷链运输至LaBESTA实验室并在2小时内完成分析。主要技术方法包括：采用VRBL琼脂平板计数法结合IMViC生化试验和API 20E系统鉴定大肠杆菌；采用Baird-Parker琼脂平板计数法结合DNase、过氧化氢酶及兔血浆凝固酶试验鉴定金黄色葡萄球菌；应用16-plex PCR（两个8-plex反应）检测大肠杆菌16种毒力基因；应用多重PCR检测金黄色葡萄球菌的毒素基因、mecA及femA；采用纸片扩散法进行抗菌药物敏感性试验，并根据CA-SFM/EUCAST 2020标准判读；采用simplex PCR检测大肠杆菌中9种获得性耐药基因（β-内酰胺酶基因bla_TEM、bla_SHV、bla_CTX-M；喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB、qnrC、qnrS、qepA；氨基糖苷乙酰转移酶基因aac(6')-Ib）。

三、研究结果

3.1 集体餐饮餐食的微生物质量

在159份餐食中，112份（70.4%）的凝固酶阳性葡萄球菌计数不合格，70份（44.0%）的耐热大肠菌群计数不合格，80份（50.3%）的大肠杆菌计数不合格。仅有21份样本（13.2%）的凝固酶阳性葡萄球菌计数达标，6份（3.8%）达到≥10⁵ CFU/g的直接健康风险水平。不同食品类别间凝固酶阳性葡萄球菌不合格率差异显著，从乳制品的33.3%到块茎类食品的90.0%。耐热大肠菌群和大肠杆菌的不合格率在不同食品类别间无统计学显著差异。基于英国健康保护署标准的敏感性分析显示，38.4%的餐食在凝固酶阳性葡萄球菌方面仍不合格。

3.2 大肠杆菌毒力基因

从63份样本中共获得149株大肠杆菌分离株进行16-plex PCR筛查，55株（36.9%）携带至少一种毒力基因，来自44份餐食（占总样本的27.7%）。最常见的基因为astA，作为唯一毒力基因在50株菌株中被检出，来自44份餐食（27.7%）。由于未检出aggR或pic，这些菌株未被归入任何致泻性大肠杆菌病理型。5份餐食（3.1%）检出携带estIa的产肠毒素性大肠杆菌（ETEC），且每份此类餐食也同时检出astA阳性菌株。未检出肠致病性大肠杆菌、产志贺毒素大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌或肠侵袭性大肠杆菌。

3.3 金黄色葡萄球菌毒力基因

在220株金黄色葡萄球菌分离株中，73株（33.2%）经PCR检测（simplex PCR确认但未测序）为表皮剥脱毒素A基因eta阳性，来自51份餐食（32.1%），覆盖所有食品类别。所有220株菌株均未携带mecA或经典肠毒素基因sea–see，eta阳性菌株中也未检出tst或etb。因此，基于所用检测面板，未能证明任何菌株具有肠毒素产生能力。

3.4 大肠杆菌抗菌药物耐药性

在50株astA阳性大肠杆菌中，耐药率最高的药物为磷霉素（82.0%，推定结果）、氨苄西林（80.0%）、头孢吡肟（70.0%）、头孢曲松（68.3%）、阿莫西林-克拉维酸（68.0%）和头孢西丁（64.0%，推定结果），其次为氯霉素（58.0%）、复方新诺明（54.0%）和替卡西林-克拉维酸（46.0%）。环丙沙星耐药率为26.0%，亚胺培南耐药率为8.0%（推定结果）。5株ETEC菌株中观察到对氨苄西林、阿莫西林-克拉维酸、复方新诺明和磷霉素的耐药。总体而言，76.0%的astA阳性菌株和3株ETEC菌株为多重耐药，合计74.5%的大肠杆菌菌株为MDR。排除推定结果后，68.0%的astA阳性菌株仍为MDR。在餐食层面，79.5%的阳性餐食至少含有一株MDR菌株。

3.5 eta阳性金黄色葡萄球菌抗菌药物耐药性

在69株可获药敏结果的eta阳性金黄色葡萄球菌中，夫西地酸和青霉素G耐药率最高（各81.2%），其次为磷霉素（50.7%，推定结果）和克林霉素（46.4%）。红霉素、复方新诺明、氧氟沙星、头孢西丁（推定结果）、氯霉素和利奈唑胺（推定结果）的耐药率分别为39.1%、30.4%、27.5%、27.5%、21.7%和20.3%。所有19株头孢西丁耐药菌株均为mecA阴性，因此不报告为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。73.9%的菌株为MDR，排除推定结果后为65.2%。

3.6 大肠杆菌获得性耐药基因

在55株携带毒力基因的大肠杆菌中，bla_SHV检出率最高（81.8%），其次为bla_CTX-M?1群（27.3%）、bla_TEM（25.5%）、aac(6')-Ib（23.6%）、qnrA（20.0%）、qepA（7.3%）和qnrS（1.8%）。未检出qnrB和qnrC。

四、讨论与结论

讨论指出，这是首次对布基纳法索集体餐饮中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行毒力基因联合分子筛查及大肠杆菌获得性耐药基因检测的研究。餐食微生物质量普遍较差，70.4%的样本凝固酶阳性葡萄球菌不合格，50.3%的大肠杆菌不合格，远高于越南河内、多哥学校食堂及布基纳法索本地常见食品的报告水平。这种污染很可能源于烹饪后的处理、常温存放及个人卫生不足。astA基因的高频检出主要指示粪便污染，而5份餐食中检出ETEC则具有更直接的公共卫生意义。金黄色葡萄球菌中eta的单独检出（需测序确认）并不预示经典的葡萄球菌食物中毒风险。大肠杆菌对多种β-内酰胺类药物的高耐药率及β-内酰胺酶基因的检出，表明这些餐食可能使消费者暴露于产β-内酰胺酶的大肠杆菌。bla_CTX-M?1群在27.3%菌株中的检出提示超广谱β-内酰胺酶编码基因在餐食中循环。多重耐药在两种菌种中均频繁出现。

研究结论部分翻译如下：瓦加杜古集体餐饮设施中供应的大部分餐食无论采用何种标准均未达到应用的微生物限值，表明微生物危害控制不足；由于未进行卫生审计或食品处理和存放观察，无法确定具体责任环节。餐食中携带astA（致病意义不确定的标志物）和较少见的ETEC的大肠杆菌，以及携带eta（经PCR检测但未测序确认）的金黄色葡萄球菌，并伴有频繁的多重耐药表型。在大肠杆菌中检出编码ESBL的bla_CTX-M?1群基因以及bla_TEM、bla_SHV和PMQR家族基因，表明这些餐食可能导致消费者暴露于抗菌药物耐药菌。尽管如此，仍需通过表型确认、最低抑菌浓度测定和测序来鉴定变异型并确定其临床相关性和可移动性。这些发现支持：（1）在集体餐饮中实施基于危害分析与关键控制点原则的卫生培训和控制措施；（2）对集体餐饮服务进行系统性微生物监测；（3）将以测序确认为支撑的食源性抗菌药物耐药性监测纳入布基纳法索的国家抗菌药物耐药性行动计划。