Saccharicterpenin（SAC）体外抗伪狂犬病病毒（PRV）的多阶段抗病毒活性研究

《Microorganisms》：Saccharicterpenin Exerts Multi-Stage Antiviral Activity Against Pseudorabies Virus In Vitro

　　

伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）变异株因现有疫苗提供的保护有限，持续威胁养猪业。本研究评估了Saccharicterpenin（SAC）——一种富含三萜皂苷（triterpenoid saponins）和多糖（polysaccharides）的植物提取物——在体外对PRV的抗病毒活性。在非细胞毒性浓度下，SAC以剂量依赖且不依赖毒株的方式抑制PRV复制（半数有效浓度EC50 = 60.12 μg/mL；选择指数SI = 3.76），表现为病毒基因组拷贝数、感染性滴度、病毒基因转录及蛋白表达水平的降低。机制分析揭示，SAC通过直接中和病毒粒子、通过降低细胞易感性提供预防性保护、损害病毒吸附（attachment）和内化（internalization）过程、减少细胞外子代病毒产量，以及减弱PRV诱导的促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8）相对mRNA表达，发挥多阶段抗病毒作用。综上所述，这些发现证明了SAC在体外对PRV具有多阶段抗病毒活性。尽管体外选择指数相对有限，但这些发现为SAC在兽医学中的进一步评估、活性组分鉴定及体内验证提供了初步证据。

论文解读文章

一、研究背景与意义

伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）是奥耶斯基病（Aujeszky's disease）的病原体，属于水痘病毒属（Varicellovirus）的有囊膜双链DNA甲型疱疹病毒。PRV感染对全球养猪业构成严峻挑战，通过新生仔猪死亡、母猪繁殖障碍和生长猪呼吸道疾病造成巨大的经济损失。PRV的一个显著特征是其能够在感觉神经节（如三叉神经节）中建立终身潜伏感染。此外，该病毒宿主范围广泛，常导致多种非猪哺乳动物发生致命性神经疾病。近年来的临床证据进一步揭示了PRV的人畜共患潜力，尤其是在人类脑炎和眼内膜炎病例中，凸显了其对公共卫生的威胁。

尽管Bartha-K61株疫苗在历史上有效控制了伪狂犬病，但自2011年以来中国出现的高毒力PRV变异株已大幅削弱了疫苗介导的保护作用。这些变异株表现出增强的致病性和对疫苗诱导免疫的部分逃逸能力，对疾病控制构成持续挑战。因此，迫切需要有效的抗病毒药物来补充现有的疫苗接种策略。

天然产物因其结构多样性和生物相容性而被视为抗病毒候选药物的重要来源。已有多种植物提取物和天然化合物显示出有前景的抗PRV活性，如山柰（Kaempferia galanga）提取物、桔梗（Platycodon grandiflorus）多糖和姜黄素（curcumin）等。Saccharicterpenin（SAC）是一种源自山茶科（Theaceae）植物的天然提取物，主要含有三萜皂苷和多糖。目前在中国已被批准作为绿色饲料添加剂，据报道可增强畜禽免疫功能、改善生长性能并促进抗氧化能力。然而，其对PRV的抗病毒活性此前尚未得到系统研究。

二、研究内容与主要技术方法

研究人员利用猪肾细胞系PK-15（porcine kidney-15 cell line）作为体外感染模型，系统评估了SAC对PRV的抗病毒活性。研究涉及三种PRV毒株：野生型田间分离株ZJ202501（分离自接种Bartha-K61疫苗但仍临床感染的猪），以及两株实验室保存的疫苗株Bartha-K61和SA215。

研究采用的主要关键技术方法包括：MTT法（四甲基偶氮唑盐比色法）评估细胞毒性；免疫荧光试验（immunofluorescence assay，IFA）检测病毒gD蛋白表达；绝对定量PCR（quantitative PCR，qPCR）靶向gB基因定量病毒基因组拷贝数；逆转录定量PCR（reverse transcription quantitative PCR，RT-qPCR）分析病毒基因（EP0、IE180、gD）转录水平和促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8）mRNA表达；蛋白质印迹法（Western blot）检测病毒gE蛋白表达；半数组织培养感染剂量（TCID₅₀）法测定病毒滴度。此外，研究还设计了多种机制性实验，包括细胞预处理实验、时间添加实验、病毒-SAC直接相互作用实验、病毒吸附实验、病毒内化实验和病毒释放实验，以阐明SAC作用于病毒感染周期的具体阶段。

三、研究结果

3.1 Saccharicterpenin在非细胞毒性浓度下体外抑制PRV复制

MTT检测显示，SAC在高达100 μg/mL浓度下处理18小时对PK-15细胞无可检测的细胞毒性。半数细胞毒性浓度（CC₅₀）为226.2 μg/mL，对PRV感染的半数有效浓度（EC₅₀）为60.12 μg/mL，选择指数（SI）为3.76。基于这些数据，研究人员选择80 μg/mL作为后续实验的非细胞毒性上限浓度。在18小时感染时间点，绝对qPCR分析显示SAC以浓度依赖方式降低病毒基因组DNA拷贝数，从病毒对照组的7.6 × 10⁸拷贝/mL降至80 μg/mL SAC处理组的3.5 × 10⁸拷贝/mL，效果与阳性对照阿昔洛韦（acyclovir，ACV，225.2 ng/mL）相当（4.3 × 10⁸拷贝/mL）。总子代病毒滴度从病毒对照组的4.9 log₁₀TCID₅₀/mL降至80 μg/mL SAC组的3.5 log₁₀TCID₅₀/mL。蛋白质印迹分析显示SAC以剂量依赖方式显著降低PRV-gE蛋白表达，IFA进一步证实病毒gD免疫荧光信号呈剂量依赖性减少。RT-qPCR分析显示病毒基因EP0、IE180和gD的mRNA表达在80 μg/mL时受到最大抑制。

3.2 Saccharicterpenin的抗病毒活性在不同病毒攻击剂量和不同PRV毒株下均表现稳健

研究人员在不同感染复数（multiplicity of infection，MOI = 7.0、0.7、0.07和0.007）条件下评估了80 μg/mL SAC的抑制作用。绝对qPCR分析显示，在所有测试的MOI条件下，病毒基因组DNA拷贝数均显著降低。在MOI为7.0时，总病毒DNA拷贝数从约5.5 × 10⁹拷贝/mL降至3.0 × 10⁹拷贝/mL；在MOI为0.07时，拷贝数从8.3 × 10⁸拷贝/mL降至2.0 × 10⁸拷贝/mL。IFA图像显示，无论初始感染压力如何，处理组的绿色荧光强度均一致降低。此外，SAC（80 μg/mL）对三种不同PRV毒株——突变疫苗株SA215、经典疫苗株Bartha-K61和野生型田间分离株ZJ202501——均表现出显著的抑制效果。总病毒基因组DNA拷贝数分别从3.3 × 10⁹降至4.0 × 10⁸拷贝/mL（SA215）、8.5 × 10⁸降至3.5 × 10⁷拷贝/mL（Bartha-K61）和2.7 × 10⁸降至1.3 × 10⁸拷贝/mL（ZJ202501）。这些结果表明SAC具有不依赖毒株的抗病毒活性。

3.3 Saccharicterpenin对PRV感染兼具预防性和早期治疗性活性

细胞预处理实验显示，用80 μg/mL SAC预处理PK-15细胞2、4或6小时后，病毒基因组DNA拷贝数呈时间依赖性降低，从病毒对照组的1.9 × 10⁸拷贝/mL分别降至8.5 × 10⁷、4.5 × 10⁷和4.0 × 10⁷拷贝/mL，表明SAC以时间依赖方式降低细胞对PRV感染的易感性。时间添加实验显示，在感染后1-7小时（Interval I）给药产生最强的抗病毒效果，总病毒基因组DNA拷贝数从对照组的1.8 × 10⁸降至7.3 × 10⁷拷贝/mL；在7-13小时（Interval II）给药也显著抑制病毒复制（1.15 × 10⁸拷贝/mL）；而在13-19小时（Interval III）给药未产生显著抑制效果（1.7 × 10⁸拷贝/mL）。这些数据表明SAC兼具预防性活性和早期抗病毒功效。

3.4 Saccharicterpenin具有直接杀病毒活性并损害PRV进入过程（吸附和内化）

直接相互作用实验中，PRV颗粒与SAC（80 μg/mL）在37°C共孵育3小时后，总病毒基因组DNA拷贝数从病毒对照组的约9.0 × 10⁷拷贝/mL骤降至3.1 × 10⁵拷贝/mL，IFA分析显示病毒gD表达荧光灶几乎完全消失，表明SAC具有直接杀病毒活性。病毒吸附实验中，在4°C条件下于吸附阶段加入SAC（20、40、80 μg/mL），导致后续病毒DNA载量从对照组的2.7 × 10⁸拷贝/mL分别降至2.0 × 10⁸、1.45 × 10⁸和1.05 × 10⁸拷贝/mL，呈浓度依赖性。病毒内化实验中，在37°C内化阶段（3小时）存在SAC时，总病毒基因组DNA拷贝数从对照组的1.2 × 10⁸拷贝/mL分别降至8.5 × 10⁷（20 μg/mL）、7.3 × 10⁷（40 μg/mL）和5.0 × 10⁷拷贝/mL（80 μg/mL）。这些发现表明SAC通过直接杀病毒活性结合损害病毒吸附和内化过程来破坏PRV感染的早期阶段。

3.5 Saccharicterpenin在感染晚期减少细胞外子代PRV产量

病毒释放实验中，感染细胞在15小时感染时间点接受SAC（20、40、80 μg/mL）处理，21小时感染时间点收集培养上清液进行分析。绝对qPCR显示，与对照组（2.0 × 10⁷拷贝/mL）相比，80 μg/mL和40 μg/mL SAC处理分别将细胞外病毒DNA载量显著降至1.36 × 10⁷拷贝/mL（p < 0.001）和1.55 × 10⁷拷贝/mL（p < 0.05），而20 μg/mL组无显著变化。细胞外感染性病毒滴度在80 μg/mL处理组从对照组的3.68 log₁₀TCID₅₀/mL显著降至2.92 log₁₀TCID₅₀/mL（p < 0.001）。这些结果表明，感染晚期开始的SAC治疗可有效减少细胞外病毒积累，可能反映病毒粒子释放受损、出芽动力学延迟或残留的晚期复制效应。

3.6 Saccharicterpenin减轻PK-15细胞中PRV诱导的促炎细胞因子基因表达

RT-qPCR分析显示，PRV感染在整个感染期间显著诱导TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的转录。与PRV感染组相比，SAC（80 μg/mL）处理在多个监测时间点显著降低了所有四种细胞因子的mRNA表达水平。其中IL-8在PRV感染后表现出快速早期诱导，而IL-1β和IL-6在感染晚期达到最高转录水平。SAC有效减弱了这些感染相关的升高，使细胞因子mRNA水平持续低于病毒对照组。单独SAC处理未诱导可检测的炎症细胞因子转录上调。这些结果表明SAC能有效抑制PRV诱导的促炎细胞因子基因表达。

四、讨论与结论

讨论部分指出，SAC作为一种在中国获批的绿色饲料添加剂，此前已被报道可促进家畜生长、增强免疫反应、维持肠道黏膜完整性并调节宿主抗氧化平衡，但其对甲型疱疹病毒的直接抗病毒活性此前未被表征。SAC的主要成分为三萜皂苷和多糖，这种双重组成可能协同促成其观察到的抗病毒效应。机制上，皂苷是两亲性化合物，可与包括胆固醇在内的膜脂相互作用，影响生物膜的性质和完整性；由于PRV是有囊膜病毒，这种相互作用可能导致直接暴露后病毒传染性的丧失。多糖组分可能通过宿主细胞表面的空间位阻效应降低受体可及性。与单纯靶向病毒gD的槲皮素（quercetin）或可能作用于gB的木犀草素（luteolin）相比，SAC可能发挥更广泛的多组分效应。此外，SAC的抗炎作用与其增强内源性抗氧化防御的能力相关，这种双重作用使其区别于主要抑制病毒DNA聚合酶但不直接解决宿主介导的炎症损伤的核苷类似物如阿昔洛韦。

研究也明确承认了若干局限性：体外选择指数相对有限（SI = 3.76），这与提取物的复杂植物性质有关；目前具体的活性成分尚未确定，需要生物活性引导的分离鉴定；吸附和内化实验的观察结果反映的是病毒进入受损对整体复制动力学的下游累积效应；病毒释放实验中观察到的细胞外产量减少不能明确归因于直接的病毒出芽机制阻滞；GAPDH作为唯一参考基因的表达稳定性未在实验条件下系统验证。

研究结论部分翻译如下：系统的体外评估证明，Saccharicterpenin（SAC）在细胞培养中对伪狂犬病病毒（PRV）发挥多阶段抗病毒活性。具体而言，SAC在感染周期的不同阶段均表现出抑制作用，涵盖直接杀病毒灭活、通过降低细胞易感性提供预防性保护、干扰病毒吸附和内化、减少细胞外子代病毒粒子产量，以及下调病毒诱导的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8转录水平。综上所述，这些结果证明了SAC的体外抗PRV特性。尽管观察到的选择指数（SI = 3.76）相对有限，提示需谨慎对待其治疗窗口，但这些初步的细胞水平发现支持进一步开展体内疗效、药代动力学以及结构或制剂优化的研究。