《Plants》：Multi-Locus Genome-Wide Association Study Identifies Stable Quantitative Trait Nucleotides and Candidate Genes for Seed Protein Content in an Early-Maturing Soybean Recombinant Inbred Line Population
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大豆种子蛋白质含量属于多基因控制的数量性状，解析其遗传架构对于推进高蛋白大豆分子育种至关重要。本研究以高蛋白品种科豆48与低蛋白品种科豆61杂交衍生的包含174个家系的F5重组自交系（recombinant inbred line，RIL）群体为材料，在四个不
大豆种子蛋白质含量属于多基因控制的数量性状，解析其遗传架构对于推进高蛋白大豆分子育种至关重要。本研究以高蛋白品种科豆48与低蛋白品种科豆61杂交衍生的包含174个家系的F5重组自交系（recombinant inbred line，RIL）群体为材料，在四个不同种植环境下对种子蛋白质含量进行表型鉴定。利用25,663个高质量单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）进行基因分型，并开展多位点全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）。表型数据显示，群体种子蛋白质含量变幅为31.24%–46.65%，广义遗传力为0.89。通过11种多位点GWAS算法共检测到54个与种子蛋白质含量相关的数量性状核苷酸（quantitative trait nucleotide，QTN）；其中，16个QTN因在同一环境内至少被两种GWAS模型检测到和/或在至少两个环境中被检测到而被归类为稳定QTN，33个QTN与已发表的种子蛋白质数量性状位点（quantitative trait locus，QTL）区间重叠。整合连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）衰减估计、种子组织表达谱、亲本重测序非同义变异及种质单倍型特征分析，优先筛选出三个候选基因：Glyma.08G246400（AFP3/NINJA-like转录抑制因子）、Glyma.09G154600（LRR类受体蛋白激酶）和Glyma.19G224000（翻译起始因子IF-2）。利用协作的2898份大豆重测序 panel 中符合条件的种质进行单倍型分析，在校正种质类型后，三个基因均检测到显著的单倍型–蛋白质含量关联，且野生大豆（Soja）、地方品种和育成品种间的单倍型分布存在差异。该研究提供了经重复检测支持的稳定QTN、三个具有生物学合理性的候选基因以及与蛋白质含量相关的单倍型，可供高蛋白早熟大豆的进一步机制解析和育种评估利用。
一、研究背景与科学问题
大豆是全球重要的粮油兼用作物，种子蛋白质含量约40%，是食品加工、动物饲料和植物蛋白生产不可替代的原料。提高种子蛋白质浓度有助于缓解全球膳食植物蛋白短缺。然而，种子蛋白质含量是由多基因控制的复杂数量性状，与油分含量和产量存在负遗传相关，这构成了高蛋白品种改良的主要瓶颈。截至2026年7月，SoyBase数据库已收录255个双亲连锁QTL和260个GWAS来源的与大豆种子蛋白质相关的QTN。尽管已报道的位点数量众多，但大多数QTL/QTN在不同遗传背景和田间环境下表现不一致，限制了其在育种中的实际应用。此外，现有研究仍存在三个局限：其一，跨多个环境和互补GWAS模型重复检测到的位点相对较少；其二，将GWAS信号与表达、功能变异和单倍型证据整合的研究仍然有限，制约了生物学解释；其三，野生大豆、地方品种和育成品种间的单倍型频率和地理分布模式尚未得到充分表征。为弥补上述不足，研究人员构建了由蛋白质含量差异显著的两个品种杂交衍生的F5双亲RIL群体，在四个环境下采集多点多环境表型数据，并利用11种互补模型结合高密度SNP标记开展GWAS，旨在鉴定稳定QTN、筛选具有多组学证据支持的候选基因，并表征不同种质类型间的单倍型频率差异及地理分布，以识别可供进一步育种评估的蛋白质相关单倍型。
二、研究内容与主要结论
研究人员利用高蛋白品种科豆48与低蛋白品种科豆61杂交构建了174个家系的F5RIL群体，在黑龙江克山（2024年、2025年）、哈尔滨（2025年）和讷河（2025年）四个环境进行田间试验，采用随机完全区组设计，三次生物学重复。通过多位点GWAS共检测到54个与种子蛋白质含量相关的QTN，其中16个被定义为稳定QTN。整合LD衰减估计、种子组织表达谱、亲本重测序非同义变异及种质单倍型特征分析，最终优先筛选出三个候选基因：Glyma.08G246400（AFP3/NINJA-like转录抑制因子）、Glyma.09G154600（LRR类受体蛋白激酶）和Glyma.19G224000（翻译起始因子IF-2）。单倍型分析在校正种质类型后，三个基因均表现出显著的单倍型–蛋白质含量关联，且不同种质类型间单倍型频率存在差异。该研究为高蛋白早熟大豆的分子育种提供了稳定的基因组位点、候选基因和蛋白质相关单倍型资源。
三、关键技术方法
研究人员主要采用了以下关键技术方法：其一，利用单粒传法构建KD48×KD61杂交衍生的F5RIL群体，经海南冬季加代加速世代进程；其二，采用SoySNP180K芯片进行高密度基因分型，经严格质控后保留25,663个高质量SNP用于分析；其三，运用ADMIXTURE和主成分分析解析群体遗传结构，以K=2作为最简约的祖先组分模型；其四，整合11种多位点GWAS算法，包括mrMLM系列六种方法（mrMLM、FASTmrMLM、FASTmrEMMA、pLARmEB、pKWmEB、ISIS EM-BLASSO）、GAPIT3三种模型（BLINK、FarmCPU、MLMM）以及3VmrMLM和Fast3VmrMLM；其五，利用PopLDdecay计算全基因组LD衰减；其六，基于协作的2898份大豆重测序panel（对应SoyOmics Variome资源，VCF经协作项目获得）进行单倍型–表型关联分析，以种质类型为协变量进行校正；其七，利用15个豆科物种参考蛋白质组进行系统发育、蛋白质结构域和残基保守性分析。样本队列来源包括：KD48和KD61亲本重测序数据为独立生成；2898份种质panel通过协作项目获得，种子蛋白质含量BLUP值来自SoyOmics Phenome资源。
四、研究结果
2.1 表型变异与遗传参数估计：四个环境下种子蛋白质含量呈正态分布，群体变幅为31.24%–46.65%，群体平均值为39.49%，广义遗传力为0.89。方差分析确认遗传效应和环境效应均显著，且存在显著的基因型×环境互作效应。
2.2 群体遗传结构：ADMIXTURE分析显示K=2为最简约模型，RIL群体仅包含来源于两个亲本的两种祖先遗传组分，无离散亚群。PCA显示PC1和PC2分别解释31.21%和11.19%的遗传变异，前三个主成分累计捕获46.40%的群体多样性。PC1–PC3作为协变量纳入所有GWAS模型以消除分层偏差。
2.3 多位点GWAS检测稳定种子蛋白质QTN：11种模型共检测到54个独特QTN，分布于17条染色体，单个位点表型变异解释率（PVE）为0.39%–61.26%。其中16个QTN被定义为稳定QTN：12个在同一环境内至少被两种模型检测到，4个在至少两个环境中被检测到。33个QTN与SoyBase已发表的种子蛋白质QTL区间重叠。16个稳定QTN位于第4、8、9、12、18、19和20号染色体。
2.4 候选基因分层筛选：全基因组LD衰减曲线达到最大值一半时的距离为1674.2 kb，但研究人员采用以QTN为中心的±100 kb（共200 kb）严格操作区间进行近端基因优先筛选。该区间内检索到179个注释基因；组织表达谱分析保留40个在至少一个发育种子阶段FPKM≥5的基因；亲本重测序非同义变异筛选进一步缩小至7个独特基因；单倍型–表型检验在校正种质类型后优先筛选出三个基因：Glyma.08G246400、Glyma.09G154600和Glyma.19G224000。
2.5 三个候选基因的单倍型–表型关联：Glyma.08G246400包含1个CDS非同义替换和13个启动子变异，形成三个整合单倍型，校正种质类型后Hap2的校正种子蛋白质含量高于Hap1（n=437，校正p=0.0012）。Glyma.09G154600包含1个错义变异定义Hap1（G）和Hap2（A），Hap2校正平均值更高（n=763，校正p=0.0018）。Glyma.19G224000包含6个CDS变异定义Hap1（GGAACC）和Hap2（ATGGTT），Hap1校正平均值更高（n=618，校正p=0.0288）。
2.6 系统发育、蛋白质结构域与残基保守性：15个豆科物种的全长蛋白质比对和邻接法分析将每个大豆候选蛋白与其野生大豆同源蛋白以100%自举支持率聚在一起。Glyma.08G246400的p.Phe109Tyr位于AFP/NINJA抑制区域，KD48的Tyr残基出现在60.0%的同源蛋白中。Glyma.09G154600的p.Ala266Val定位于胞外LRR区域，KD48的Val和KD61/Wm82的Ala分别出现在66.7%和26.7%的同源蛋白中。Glyma.19G224000的六个错义替换分别定位于IF2 N端区域、EF-Tu-like GTP结合结构域和EF-Tu结构域2，各残基在两个亲本间的保守性呈现混合模式。
2.7 单倍型频率与地理分布：Glyma.08G246400的高蛋白相关Hap2在野生大豆、地方品种和育成品种中的频率分别为33.33%、54.85%和67.02%，携带者主要分布于黑龙江、山西和河南。Glyma.09G154600的Hap2频率分别为76.19%、39.69%和31.95%，许多携带者采自黄淮地区。Glyma.19G224000的Hap1频率分别为96.88%、49.85%和60.00%，携带者分布于东北、华北和黄淮地区。
五、讨论与结论
讨论部分指出，该RIL群体种子蛋白质含量呈连续正态分布且广义遗传力高，验证了表型数据的可靠性，但显著的G×E互作说明单一环境表型鉴定无法识别普遍稳定的高蛋白品系。多模型联合GWAS策略通过跨模型和/或跨环境重复检测标准筛选出16个稳定QTN，33个QTN与已发表QTL重叠证实了关联信号的真实性，21个未见报道的位点扩展了现有大豆基因组资源。三个候选基因的注释分别涉及转录抑制、信号转导和翻译起始，为种子蛋白质变异提供了推测性的功能框架，但因果关系仍需转基因或基因编辑验证。单倍型频率在三种种质类型间的差异不能证明定向选择或等位基因丢失。研究局限性包括：群体规模较小限制微效QTN检测并存在Beavis效应；缺乏基因功能验证；环境覆盖有限；未进行基因上位性分析；进化推断仅为描述性。未来研究方向包括通过基因编辑、互作分析和转录组学进行机制验证，以及通过基因特异性KASP标记验证、蛋白质相关单倍型组合测试和Glyma.09G154600 Hap2在栽培背景中的评估开展育种评价。
研究结论为：利用双亲早熟大豆RIL群体在四个田间环境下的表型数据和11种互补多位点GWAS算法，在预定义的跨模型和/或跨环境重复检测标准下鉴定出16个稳定种子蛋白质QTN，其中12个在同一环境内被多种模型支持，4个在至少两个环境中被检测到。这些QTN位于第4、8、9、12、18、19和20号染色体。通过LD区间基因检索、发育种子表达过滤、亲本非同义变异筛选和单倍型–表型关联检验四个候选基因筛选步骤，优先筛选出三个候选基因Glyma.08G246400、Glyma.09G154600和Glyma.19G224000，其推测注释分别涉及转录抑制、信号转导和翻译。对2898份协作panel中符合条件的子集进行单倍型分析，三个基因在校正种质类型后均检测到显著关联，并揭示了不同的单倍型频率和地理分布模式。该研究为高蛋白早熟大豆的进一步机制解析和育种评估提供了稳定基因组位点、候选基因和蛋白质相关单倍型。
