利福平共暴露增强氯虫苯甲酰胺对斑马鱼（Danio rerio）的急性毒性

《Toxics》：Rifampicin Co-Exposure Increases the Acute Toxicity of Chlorantraniliprole to Zebrafish (Danio rerio)

　　

农药与抗生素在水环境中频繁共存，但它们对水生生物的综合影响仍知之甚少。本研究评估了抗生素共暴露是否改变幼年斑马鱼（Danio rerio）的农药毒性。五种农药——氯虫苯甲酰胺（chlorantraniliprole, CAP）、毒死蜱（chlorpyrifos, CPF）、噻嗪酮（buprofezin, BPF）、苯醚甲环唑（difenoconazole, DFZ）和啶酰菌胺（boscalid, BO）——分别单独以及与利福平（rifampicin, RIF）、氨苄西林（ampicillin, AMP）和四环素（tetracycline, TET）联合测试；DFZ和BO仅与RIF和AMP联合测试，三元混合物仅针对CAP、CPF和BPF进行测试。基于名义浓度，添加RIF（50 mg/L）增加了CAP的毒性，将其96 h LC50从61.85 mg/L降低至40.72 mg/L（LC50比值，LCR = 1.52）；当同时添加AMP或TET时，这种毒性增加不再被观察到。对于CPF，仅三元混合物（与RIF和AMP）轻微降低了毒性（LCR = 0.95）。对于BPF，仅与TET共暴露增加了毒性（LCR = 1.18）。DFZ和BO在与RIF或AMP共暴露时显示出毒性降低（LCR范围为0.80–0.91）。除CAP + RIF组合外，变化均较小（≤20%）。这些不同的反应表明，抗生素–农药相互作用具有化学特异性。由于本研究中使用的抗生素浓度相对于环境水平较高，且暴露浓度未经分析验证，这些发现仅指示实验条件下可能存在的相互作用，而非环境混合物的风险，并表明单一化合物毒性数据可能不足以评估多污染物环境中农药的危害。

研究背景与问题

农药是全球农业系统中广泛使用的农用化学品，其持续施用导致地表水和沉积物中频繁检出。全球评估显示，超过一半的实测地表水农药浓度超过了监管阈值水平，即使在阈值浓度下，水生大型无脊椎动物生物多样性也已下降。合成有机污染物（包括农药）在水环境中很少单独存在，而是作为复杂化学混合物与其他人为污染物一同进入水体。农药的生态效应超出了其预期的农业靶标：杀虫剂、杀菌剂和昆虫生长调节剂已被报道会干扰鱼类肝脏代谢和肠道微生物群，损害神经递质含量和胚胎发育，并破坏淡水藻类的光合作用和能量代谢，表明农药毒性跨越分类群和营养级。即使是因其选择性、靶标特异性作用方式而备受推崇的农药，对非靶标水生生物也未必无害：氯虫苯甲酰胺（CAP）是一种作用于昆虫兰尼碱受体的邻氨基苯甲酰胺类杀虫剂，可触发不受控制的钙释放并导致靶标害虫致命性肌肉麻痹，但在斑马鱼中即使内部剂量较低也会扰乱肝脏功能和代谢谱。这些发现共同强调了有必要将农药毒性评估置于生物体实际遭遇的复杂化学混合物背景下，而非孤立的单一化合物暴露。

抗生素同样已成为水生生态系统中普遍存在的污染物，通过废水排放、水产养殖、畜牧生产、医院污水和日常人类药物使用进入地表水。抗生素的生态意义不仅限于对水生生物的直接毒性：它们还可以重塑微生物群落组成和活性，从而改变共存污染物的生物降解和转化。由于微生物活性驱动水生系统中的农药降解，抗生素污染可以间接影响共存农药的持久性和生物可利用性，并对宿主解毒能力和肠道微生物组功能产生进一步影响。

当一种污染物改变另一种污染物的持久性、生物可利用性或生物转化时，化学混合物的毒理学后果变得尤为重要。环境风险评估框架长期以来一直警告，单独评估化学品可能会显著低估生物体暴露于复杂混合物或发生协同相互作用时的风险。已有直接证据表明抗生素可以改变农药毒性，主要来自昆虫模型：氨苄西林改变了蚜虫对吡虫啉和氰虫酰胺的反应，而利福平增加了桃蚜（Myzus persicae）对杀虫剂的敏感性。肠道微生物群也被证明更广泛地影响昆虫对杀虫剂的敏感性。农药与抗菌化合物的联合暴露在其他水生无脊椎动物中也进行了检验：在卤虫（Artemia salina）中，与有机磷杀虫剂毒死蜱和抗菌剂三氯生的共暴露改变了急性LC₅₀值和胆碱酯酶活性，表明农药–抗菌剂相互作用并不局限于脊椎动物模型。由于抗生素和农药均可作为鱼类细胞色素P450依赖性生物转化途径的底物、诱导剂或抑制剂，共暴露可以改变解毒能力和氧化应激反应。关于此类相互作用的直接证据在水生脊椎动物中正逐渐出现，涉及少数农药-抗生素配对。然而，抗生素共暴露是否广泛改变常用杀虫剂和杀菌剂对鱼类的急性毒性，在很大程度上仍未探索，这代表了当前水生生态系统混合物毒性评估中的一个重要空白。

研究内容与结论

鉴于上述空白，本研究旨在确定与常见抗生素共暴露是否会改变农药对幼年斑马鱼（Danio rerio）的急性毒性。研究人员选择了五种广泛用于农业害虫防治的农药：氯虫苯甲酰胺（CAP）、毒死蜱（CPF）、噻嗪酮（BPF）、苯醚甲环唑（DFZ）和啶酰菌胺（BO），以及三种最广泛使用的人类和兽医抗生素：利福平（RIF）、氨苄西林（AMP）和四环素（TET）。通过比较每种农药单独及其与这些抗生素二元和三元组合下的96小时半数致死浓度（LC₅₀）值和LC₅₀比值，本研究旨在确定抗生素共暴露是否以及在多大程度上改变所选农药在脊椎动物水生模型中的96小时急性毒性。研究发现，抗生素共暴露可以增加、减少或对农药急性毒性无显著影响，具体取决于所测试的特定农药-抗生素组合。其中最显著的发现是RIF增强了CAP的毒性，使96 h LC₅₀从61.85 mg/L降至40.72 mg/L，LC₅₀比值为1.52。其他组合的变化幅度较小（≤20%）。这些发现表明，抗生素–农药相互作用具有化学特异性，单一化合物毒性数据可能不足以评估多污染物环境中农药的危害。

关键技术方法

研究人员采用半静态法进行96小时急性毒性试验，该方法改编自OECD指南203，使用约2月龄的斑马鱼（AB品系，中国科学院水生生物研究所提供）作为测试生物。农药和抗生素原液均以丙酮配制。通过预实验确定各农药产生部分死亡率的浓度系列（5–6个名义浓度）以及抗生素的非致死浓度（50 mg/L）。每个浓度设置2–3个重复玻璃缸，每缸含1 L测试溶液和10尾幼鱼，每24小时更换测试溶液，记录96小时内死亡率。使用PoloPlus软件（版本1.0）通过概率单位模型计算96 h LC₅₀值、95%置信限（CLs）以及不同毒性回归线之间的LC₅₀比值（LCRs）及其95% CLs。

研究结果

3.1 氯虫苯甲酰胺（CAP）单独及与抗生素联合的急性毒性

CAP单独暴露的96 h LC₅₀为61.85 mg/L。与RIF共暴露显著增加了CAP的毒性，LC₅₀降至40.72 mg/L，LCR为1.52（95% CL: 1.45–4.59），其95% CL不包含1.0。相反，添加AMP或TET显著降低了CAP毒性，LC₅₀分别为66.84 mg/L和66.42 mg/L，LCRs分别为0.92（0.90–0.95）和0.93（0.90–0.96），两者95% CL均排除1。在三元混合物中，两种抗生素的存在未显著改变CAP的毒性，LCRs分别为1.02、1.04和1.00，所有95% CL均包含1。这表明在二元混合物中观察到的RIF诱导的CAP毒性增加，在加入第二种抗生素（AMP或TET）后不再出现。

3.2 毒死蜱（CPF）单独及与抗生素联合的急性毒性

CPF单独暴露的96 h LC₅₀为2.13 mg/L。与RIF、AMP和TET联合的LC₅₀分别为2.03、2.10和2.08 mg/L，对应LCRs为1.05、1.01和1.03。在三元混合物中，仅CPF + RIF + AMP组合的LC₅₀为2.25 mg/L（LCR = 0.95, 95% CL 0.91–0.99），与CPF单独暴露相比有显著差异。总体而言，CPF在所有抗生素组合下的LC₅₀值变化不大，LCRs接近1.0。

3.3 噻嗪酮（BPF）单独及与抗生素联合的急性毒性

BPF单独暴露的LC₅₀为2.50 mg/L。与RIF、AMP和TET共暴露使LC₅₀分别降至2.19、2.26和2.10 mg/L，对应LCRs为1.14、1.10和1.18。BPF + TET组合产生了二元处理中最明显的毒性增加（LCR = 1.18, 95% CL: 1.05–1.33）。在三元混合物中，LCRs范围为0.93至1.04，表明二元组合中观察到的毒性增加在加入第二种抗生素后未能持续维持。

3.4 苯醚甲环唑（DFZ）单独及与抗生素联合的急性毒性

DFZ单独暴露的LC₅₀为1.28 mg/L。与RIF和AMP共暴露使LC₅₀分别增至1.41和1.52 mg/L，对应LCRs低于1.0（0.91和0.85，均具有统计学显著性），表明在这两种抗生素存在下DFZ的急性毒性降低。

3.5 啶酰菌胺（BO）单独及与抗生素联合的急性毒性

BO单独暴露的LC₅₀为1.05 mg/L。与DFZ类似，与RIF和AMP共暴露使BO的LC₅₀分别增至1.30和1.16 mg/L，产生显著的LCRs为0.80和0.90，表明BO急性毒性在这些抗生素存在下降低而非增加。

讨论与结论总结

讨论部分指出，本研究中抗生素共暴露对农药急性毒性的影响呈现化学特异性，其中RIF增强CAP毒性是最显著的发现（LCR=1.52），但该效应仅为RIF所特有，AMP或TET并未增强CAP毒性反而略有降低，且加入第二种抗生素后RIF效应消失。这一特异性与先前在蚜虫等模型中的发现一致，支持抗生素–农药相互作用是化学特异性的观点。除CAP+RIF外，所有统计显著的LCRs范围在0.80至1.18之间，即LC₅₀变化≤20%，且未进行多重比较校正，因此需区分统计显著性与生物学/环境显著性。研究人员提出了两个假说机制：一是细胞色素P450介导的代谢，RIF可能影响CAP的生物转化或清除；二是肠道微生物组扰动，RIF作为广谱抗生素可能改变微生物群落从而影响宿主对CAP的反应。然而，这两个假说均缺乏直接的生化、毒代动力学或微生物学数据支持，且第二个假说存在逻辑缺陷（若为一般性微生物组扰动，其他抗生素也应产生类似效应），因此仍属推测。

研究结论：本研究发现抗生素共暴露可以改变特定农药对幼年斑马鱼的96小时急性毒性，且响应的方向和幅度因农药-抗生素组合而异。最显著的反应是在当前实验条件下RIF相关的CAP毒性增加（LCR=1.52），但由于名义暴露浓度、高抗生素浓度以及缺乏机制终点，该变化应谨慎解读。根据所测试的组合，抗生素共暴露增加、减少或对CPF、BPF、DFZ和BO的急性毒性无显著影响。本研究测试了五种农药和三种抗生素，但未评估所有可能的组合。因此，这些发现提供了所选农药-抗生素组合的初步评估，而非全面的混合物风险评估；需要使用经分析验证的、环境相关的浓度，系统的水质和健康监测以及机制终点进行进一步研究，以确定这些相互作用的基础和生态意义。