《Bioengineering》：A Real-Time Automated Deep Learning Workflow for Non-Invasive High-Magnification Imaging of C. elegans
编辑推荐：
秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）是衰老与神经生物学研究的首选模式生物，因其寿命短、光学透明、遗传可操作性强以及神经系统图谱清晰而备受重视。在不进行固定处理的前提下实现自动化成像是重要目标，因为它可以减少对麻醉、约束和反复操作的依赖。
秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）是衰老与神经生物学研究的首选模式生物，因其寿命短、光学透明、遗传可操作性强以及神经系统图谱清晰而备受重视。在不进行固定处理的前提下实现自动化成像是重要目标，因为它可以减少对麻醉、约束和反复操作的依赖。然而，对自由运动的线虫进行高倍率成像仍具挑战性。放大倍数增加会缩小视场（field of view），导致目标丢失、运动模糊和焦面漂移。固定方法可能改变生理状态、抑制自然行为，并限制纵向观察。本研究提出了一种全自动实时追踪工作流程，用于在受控培养条件下对微流控平台中的单个线虫进行成像。该系统集成了基于深度学习的头部检测、基于图像的自动对焦以及快速电动载物台反馈，以支持对自由运动线虫的高倍成像。追踪与图像采集使用同一显微镜和物镜。该平台将个体线虫分别饲养于微流控环境中，同时保持动物身份标识以实现重复成像。整套系统完全由商用设备搭建而成，无需额外定制追踪硬件，并提供模块化、用户可配置的追踪参数，以适应特定实验目标。
一、研究背景、现存问题与研究意义
秀丽隐杆线虫（C. elegans）因寿命短、光学透明、遗传可操作性强以及神经系统完整图谱等优势，成为衰老与神经生物学研究的核心模式生物。然而，传统线虫实验依赖人工手动挑取、监测和评分，耗时费力，限制了通量并引入主观误差。为实现高通量与高分辨率成像，已有多种自动化系统被开发，如CARIBN II、Lifespan Machine、WorMotel、Wormspy等，但这些系统或在长时间培养中缺乏流体控制与环境调控，或依赖固定（如FUdR药物、冷却、微流控约束）从而干扰生理与行为，或无法在高倍镜下对自由运动个体进行实时追踪。现有微流控平台如WormFarm、NemaLife、WormSpa、HeALTH、Lifespan-on-a-chip等虽改善了环境控制与长期培养，但在个体身份保持、无固定高倍追踪方面仍有局限。因此，亟需一种将微流控培养、深度学习实时追踪与高倍成像相结合的无固定自动化平台。
研究人员开发了一套全自动实时追踪工作流，整合了基于YOLO的头部检测与虫体分割、基于图像的自动对焦以及快速电动载物台反馈，在商用倒置显微镜上实现了对自由运动线虫在10×、20×和40×物镜下的稳定成像。系统采用条件式重定位策略减少不必要的载物台移动，并在虫体短暂静止时触发荧光采集，避免了化学或物理固定。该平台包含384个独立培养腔室，支持个体身份保持、自动喂食、环境调控及子代清除，可在24小时内完成多轮自动成像。结果表明，在40×物镜下追踪延续成功率可达88.1%，整体可接受图像产出率为97.4%，成功获取了自由运动状态下AIY神经元（头部中间神经元）的清晰荧光图像，验证了无固定高倍成像的可行性。
二、主要关键技术方法
- 1.
深度学习模型：基于Ultralytics YOLO26框架，训练了头部定向边界框（OBB）检测模型（YOLO26n-obb）和虫体分割模型（YOLO26n-seg）。数据集包含12,000张成年线虫图像（含野生型N2及矮小突变株CB88、CB128），经半自动标注（CVAT工具）后按70:20:10划分训练、验证与测试集。模型在NVIDIA RTX 5000 Ada GPU上训练，推理延迟约42.4 ms/帧。
- 2.
微流控芯片：聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片含384个长六边形培养腔室（3800 μm × 1700 μm），内置200 μm微柱。外接压力驱动流体系统，支持6种溶液独立输送至6组64个腔室，通过交替正反向流动清除子代。
- 3.
自动对焦（autofocus）：结合红外硬件自适应焦点控制（AFC）与基于图像的锐度评估。在追踪过程中，利用虫体分割掩膜屏蔽背景干扰，采用Tenengrad、Sobel方差和拉普拉斯方差三种梯度指标计算掩膜区域内的锐度，确定最佳焦面。
- 4.
追踪工作流：通过平铺扫描定位虫头，启动基于BoT-SORT算法的帧间关联追踪。条件式重定位在虫头接近视场边缘（约75%宽度）时触发，保持追踪稳定。不活动判定标准为虫头中心在50 μm直径圆内停留200 ms，随后触发5 ms荧光曝光，并结合前后亮场图像验证位置稳定性。
三、研究结果
3.1 追踪系统概述：系统由Leica DMi8倒置显微镜、Kinetix22高速相机（sCMOS，最高664 fps）、LMT精密电动XY载物台（速度达500 mm/s，精度±1.0 μm）组成。LabVIEW界面集成控制，支持10×、20×、40×物镜下的XY平面追踪与轴向焦点控制。
3.2 追踪工作流：40×物镜下，30幅平铺扫描约需2秒，检测到虫头即停止扫描并启动追踪。条件式重定位仅在虫头靠近300 μm直径圆形靶区边界时触发，减少不必要的载物台移动。自动对焦与追踪并行运行，确定最佳焦面后锁定Z轴。不活动触发荧光采集，若120秒内未满足条件则跳过该腔室，后续可重新访问。系统在24小时内完成了4轮成像，每只虫平均获得约4张高质量图像。
3.3 焦点优化：针对全图锐度曲线多峰问题，研究人员采用虫体分割掩膜限制锐度计算区域，使Tenengrad、Sobel方差和拉普拉斯方差均呈现单峰分布，峰值接近预设最佳焦面（z=0）。在225次自动对焦事件中，约55%在6步内达到最优焦面，平均耗时10.95 ± 6.47秒。
3.4 追踪性能优化：YOLO置信度阈值显著影响追踪起始率（TI）与延续率（TC）。在70%阈值下，TI为34.4%，TC为88.1%，综合性能为30.3%。起始失败主因（约97%）为虫体处于扫描区域外（如垂直连接通道或已扫过的瓷砖），仅3%为漏检。在384只虫的自动成像实验中，初始轮次成功成像比例为32.6%–54.2%（均值41.4%），高于阈值实验估计值。自由运动与固定线虫的对比显示，40×物镜下AIY荧光图像清晰可辨，证实无固定高倍成像的可行性。
3.5 可定制的追踪LabVIEW界面：界面提供手动控制面板（滤光片、照明、物镜切换等）与自动化参数设置（自动对焦步长、超时时间、不活动半径与持续时间、位移乘数等）。支持单腔室靶向成像和多腔室顺序成像（ImageLane工作流），可针对不同实验设计灵活调整。
四、讨论与结论
讨论部分指出，本系统采用条件式重定位而非连续重定位，减少了不必要的载物台修正，保持了追踪稳定性。自动对焦与追踪并行运行，通过小步长轴向采样实现精细焦点调整，尤其适用于虫头在微流控腔室内的垂直移动。不活动触发的荧光采集（5 ms曝光）占整个追踪周期比例极低（0.1%），旨在降低光毒性与光诱导行为干扰。与低倍追踪后再切换高倍的系统不同，本平台在同一物镜下完成追踪与成像，简化了硬件配置。研究人员强调，YOLO模型性能仅限于当前腔室几何结构，更换设计需重新训练验证。追踪延续率高表明闭环系统足够快速稳健，而起始率低主要反映虫体可用性问题，可通过引入流动步骤提高扫描前虫体在腔室内的概率。LabVIEW界面的可定制性便于不同实验室调整参数。
结论部分翻译如下：本研究开发了一套实时追踪工作流，能够在无需固定的情况下对自由运动的秀丽隐杆线虫进行高倍成像。通过将微流控培养平台与头部检测、虫体分割、快速载物台反馈和基于图像的自动对焦相结合，该系统在受控培养条件下维持稳定成像的同时保留了动物的自然行为。一旦追踪启动，工作流可靠地将虫体保持在视场内，而在短暂静止期采集图像有助于减少运动模糊并提高图像质量。代表性的明场和荧光图像显示了自由运动线虫清晰的解剖细节和AIY荧光信号，支持了无需物理或化学约束的高倍成像。该平台为个体线虫的重复高分辨率成像奠定了基础，在衰老、神经退行性疾病和行为研究中具有潜在应用价值。未来工作将应用该平台研究纵向神经元活动、突触组织与亚细胞病理学，并使用合适的报告基因和已验证的定量测量方法将成像延伸至整个成年生命周期。
