UFSP2通过去UFMylation依赖性激活AKT致癌信号构成结直肠癌可靶向脆弱性

《Cell Reports》：UFSP2 constitutes a targetable vulnerability via deUFMylation-dependent activation of AKT oncogenic signaling

　　

AKT过度激活是许多人类癌症的标志，并与不良临床结局相关，但其潜在机制仍未完全阐明。此处，研究人员证明AKT发生UFM化（UFMylation），且AKT UFM化的缺失促进结直肠肿瘤发展并赋予对AKT抑制剂AZD5363（capivasertib）的耐药性。此外，p53在细胞周期中激活泛素折叠修饰蛋白1（UFM1）以抑制AKT活性。相反，AKT磷酸化UFM1以减少其自身UFM化，从而建立维持AKT活性的反馈环路。此外，研究人员提供证据表明UFSP2作为AKT的主要细胞去UFM化酶（deUFMylase）发挥作用，而UFSP2的遗传消融或抑制可抑制AKT活性，从而在体内延缓肿瘤发生。总之，这些发现为UFM化依赖性AKT调控提供了机制框架，并支持进一步研究将UFSP2抑制作为调节结直肠癌中AKT信号的潜在策略。

AKT（丝氨酸/苏氨酸激酶）过度激活是许多人类癌症的标志并与不良临床结局相关，但其潜在机制尚未完全阐明；AKT激活主要受苏氨酸308（T³⁰⁸）和丝氨酸473（S⁴⁷³）磷酸化调控，同时甲基化、羟化、乙酰化和SUMO化等翻译后修饰亦参与精细调节。UFM化（UFMylation，一种类泛素化翻译后修饰）由UBA5、UFC1、UFL1（UFM1连接酶1）及去UFM化酶UFSP1/2介导，参与内质网稳态和应激反应，但其在结直肠癌（colorectal cancer，CRC）及AKT致癌信号中的生理作用尚不清楚。为此，研究人员系统研究AKT的UFM化及其在CRC中的作用与可靶向性，发现AKT发生UFM化并可抑制其激酶活性，AKT UFM化缺失促进肿瘤发展并导致AZD5363（capivasertib）耐药；p53（肿瘤蛋白p53）在细胞周期中转录激活泛素折叠修饰蛋白1（ubiquitin-fold modifier 1，UFM1）以抑制AKT；AKT反过来磷酸化UFM1形成反馈环路；UFSP2（UFM1特异性蛋白酶2）作为AKT主要去UFM化酶促进AKT激活，抑制UFSP2可减弱AKT致癌信号并延缓肿瘤发生。该研究为UFM化依赖性AKT调控提供机制框架，并支持将UFSP2抑制作为CRC中调节AKT信号的潜在策略。

关键技术方法：研究人员以Flag-UFM1免疫沉淀结合质谱（mass spectrometry，MS）鉴定UFM1互作蛋白；用免疫印迹、免疫沉淀和GST pull-down验证蛋白互作与UFM化；用CRISPR/Cas9构建UFL1、UFM1、UFSP1/UFSP2、TP53及AKT1/2敲除细胞和赖氨酸到精氨酸（K-to-R）位点突变体；用染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）和荧光素酶报告检测p53对UFM1的转录调控；用体外激酶实验检测AKT对UFM1 S⁸⁴的磷酸化；用集落形成、CCK8细胞活力、异种移植和免疫组化（immunohistochemistry，IHC）评价增殖、药物敏感性和体内肿瘤生长。CRC标本来自Bioaitech（西安，中国），经西安交通大学第一附属医院伦理批准；生存分析数据来自R2数据库。

研究结果：
1. Identification of AKT as a downstream substrate for UFMylation（AKT被鉴定为UFM化的下游底物）。研究人员通过Flag-UFM1免疫沉淀-质谱在HCT116 CRC细胞中鉴定AKT1为UFM1互作蛋白/候选底物，并用免疫共沉淀和GST pull-down验证AKT1与UFL1互作及内源互作；UBA5或UFC1过表达增强AKT1 UFM化，UBA5抑制剂DKM 2-93降低AKT1 UFM化；失活Δ3 UFM1不能修饰AKT1，UFM1缺失细胞回补野生型而非Δ3 UFM1恢复AKT1 UFM化；UFM化信号主要位于AKT1的linker和疏水motif（HM）域，质谱鉴定K111和K426，2K/R（K111R/K426R）降低而7K/R（linker和HM域全部赖氨酸突变）几乎消除可检测UFM化。结论：AKT是UFM化底物，且可能在多个赖氨酸位点被修饰。

2. UFMylation inhibits AKT kinase activity, and its absence confers AZD5363 resistance（UFM化抑制AKT激酶活性，其缺失赋予AZD5363耐药）。UFL1敲除增加pS⁴⁷³-AKT、pT³⁰⁸-AKT及pT²⁴⁶-PRAS40（AKT底物），但不明显改变S6K（核糖体蛋白S6激酶）和SGK（血清/糖皮质激素调节激酶）磷酸化；DKM 2-93在PTEN（phosphatase and tensin homolog，磷酸酶与张力蛋白同源物） proficient HCT116中增强AKT活性，而在PTEN缺陷细胞中抑制AKT活性；不同AKT构象下UFM化赖氨酸位点偏好不同。UFL1敲除促进集落形成和异种移植肿瘤生长并升高p-AKT，CRC组织中UFL1低表达与p-AKT负相关；UFL1缺失降低AZD5363对AKT活性和集落形成的抑制并导致细胞耐药；UFM1缺失增加AKT磷酸化和集落形成，回补野生型而非Δ3 UFM1可逆转；7K/R AKT1回补增加p-AKT、集落形成和肿瘤生长，并赋予AZD5363耐药。结论：UFM化抑制AKT激酶活性，阻断UFM化可导致CRC对AZD5363获得性耐药。

3. p53 transcriptionally activates UFM1 to inhibit AKT kinase activity（p53转录激活UFM1以抑制AKT激酶活性）。细胞周期中UFM1蛋白水平波动并与AKT活性呈负相关，UFM1敲除增加不同细胞周期阶段的AKT活性；敲除候选E3泛素连接酶未明显改变UFMylation系统蛋白丰度，提示转录调控；UCSC分析发现UFM1启动子区p53反应元件（RE），ChIP证实p53招募，荧光素酶报告显示野生型而非突变型p53-RE响应p53；TP53缺失降低UFM1并增加AKT磷酸化，细胞周期中p53水平与p-AKT呈负相关；Nutlin-3a激活p53增加UFM1并抑制AKT信号，TP53缺失减弱该效应，UFM1敲除逆转p53激活对AKT磷酸化的抑制；Nutlin-3a抑制野生型AKT1而非7K/R AKT1的p-AKT；TP53缺失降低AZD5363对PRAS40磷酸化、集落形成和细胞活力的抑制，UFM1回补部分恢复敏感性。结论：p53通过转录激活UFM1抑制AKT激酶活性，构成“刹车”机制。

4. AKT phosphorylates UFM1 as a feedback regulatory mechanism to sustain AKT activity（AKT磷酸化UFM1作为维持AKT活性的反馈调控机制）。UFM化减少AKT1与PDK1（phosphoinositide-dependent kinase 1，磷酸肌醇依赖性激酶1）和SIN1（mTORC2组分）结合，7K/R AKT1无此减少；UFM1含AKT共识磷酸化位点S⁸⁴，体外激酶实验显示AKT磷酸化野生型UFM1而非S⁸⁴A突变体；S⁸⁴A UFM1增强与AKT1结合，S⁸⁴D磷酸化模拟体降低与UFL1结合并减少AKT1 UFM化，且不能抑制UFM1缺失引起的p-AKT升高；胰岛素刺激后pS⁸⁴-UFM1升高、AKT UFM化降低，AKT活性淬灭后AKT UFM化恢复；UFM1特异性结合14-3-3γ（衔接蛋白），激活AKT增强野生型而非S⁸⁴A UFM1与14-3-3γ结合，14-3-3γ缺失减弱AKT介导的UFM1-UFL1互作减少；S⁸⁴A回补抑制集落形成，S⁸⁴D不能。结论：AKT磷酸化前体UFM1 S⁸⁴，促进14-3-3γ结合、减少UFM1-UFL1互作并削弱AKT UFM化，从而形成维持AKT活性的反馈环路。

5. UFSP2 functions as a major cellular deUFMylase for AKT and promotes its activation（UFSP2作为AKT的主要细胞去UFM化酶并促进其激活）。野生型而非酶失活UFSP2抑制AKT1 UFM化，UFSP1作用较弱；UFSP2单敲不消除AKT UFM化，UFSP1/UFSP2双敲消除AKT UFM化，UFSP1可部分补偿UFM1成熟；在成熟UFM1 ΔC2条件下UFSP2降低AKT UFM化而UFSP1不，UFSP2敲除增强AKT UFM化而UFSP1敲除不明显。UFSP2过表达增强AKT磷酸化且被AKTi-1/2抑制，UFSP2抑制剂降低多种癌细胞p-AKT，UFSP2敲除降低p-AKT及胰岛素刺激后AKT磷酸化，回补野生型而非酶死UFSP2恢复；UFSP2抑制剂在UFL1缺失细胞中不能抑制AKT激活，7K/R AKT1回补后UFSP2抑制剂作用减弱。结论：UFSP2是AKT主要去UFM化酶，负调控AKT1 UFM化并促进AKT激活。

6. Inhibition of UFSP2 suppresses tumorigenesis in part by attenuating AKT oncogenic signaling（抑制UFSP2部分通过减弱AKT致癌信号抑制肿瘤发生）。高UFSP2表达与CRC患者较差总生存相关；UFSP2抑制剂以剂量和时间依赖方式降低多种癌细胞活力，UFSP2敲除抑制CRC细胞集落形成；UFSP2抑制剂与UFSP2敲除无叠加抑制，回补野生型而非催化失活UFSP2恢复表型并降低抑制剂敏感性；UFSP2抑制剂降低CRC细胞活力和集落形成，UFL1缺失减弱该效应但抑制剂仍有一定独立作用，2K/R或7K/R AKT1回补恢复细胞活力；异种移植中AKT1/2^?/?肿瘤较小，UFSP2抑制剂抑制野生型HCT116肿瘤生长至类似AKT1/2敲除水平，对AKT1/2^?/?无进一步抑制；UFSP2敲除减少肿瘤生长和p-AKT，AKT抑制剂对UFSP2^?/?细胞效果较小；在UFL1^?/?或TP53^?/?细胞中，UFSP2抑制剂与AKTi-1/2联用降低细胞活力和AKT激酶活性。结论：UFSP2是结直肠肿瘤发展的重要调控因子，抑制UFSP2可部分通过减弱AKT致癌信号抑制肿瘤发生。

讨论部分总结：讨论指出，AKT调控除磷酸化外还存在UFM化这一抑制层；在CRC中UFM化作为AKT致癌信号的“分子刹车”，p53转录激活UFM1可解释细胞周期中AKT活性波动，TP53缺失降低AZD5363敏感性部分通过AKT-UFM化通路。与三阴性乳腺癌中UFL1的致癌作用看似矛盾，研究人员提出背景依赖性模型：低基础AKT活性时UFM化优先发生于linker/HM域并抑制AKT激活，高活性AKT时激酶域赖氨酸暴露，UFM化可能重定向至激酶域并维持高活性状态。UFSP1和UFSP2均参与UFM1成熟，但UFSP2是去除AKT上UFM1的主要去UFM化酶，异常UFSP2活性可能促进AKT激活和肿瘤进展。AKT磷酸化UFM1 S⁸⁴促进14-3-3γ结合并减少UFM1-UFL1互作，构成放大AKT信号的反馈环路。局限包括背景依赖性模型证据有限、S⁸⁴调控UFM1成熟的精确机制不清、各UFM化位点的化学计量和相对贡献不清，以及UFSP2广泛调节UFM化通路，需进一步评估药理抑制的特异性、系统效应和长期治疗安全性。研究结论翻译：总体而言，该工作支持UFM化（UFMylation）作为AKT调控的重要机制，并支持进一步研究UFSP2作为调节CRC中AKT信号的潜在策略。