苦瓜YABBY基因家族的全基因组鉴定与表达分析

《Biology》：Genome-Wide Identification and Expression Analysis of the YABBY Gene Family in Bitter Gourd

　　

YABBY转录因子参与植物果实发育、叶片极性建立以及对胁迫的适应。苦瓜（Momordica charantia L.）是一种重要的葫芦科作物，但该物种中YABBY基因尚未见报道。本研究利用苦瓜T2T基因组对YABBY基因家族进行了数字化鉴定，并通过生物信息学与实验方法分析了每个基因成员的序列特征、系统发育关系及表达谱。共鉴定到8个YABBY同源基因，命名为McYABBY1（Momordica charantia YABBY1）至McYABBY8，在系统发育树中聚为五个分支，每个分支均与对应的拟南芥（Arabidopsis）基因呈现清晰的直系同源关系。RNA-seq数据和RT-qPCR结果显示，McYABBY基因在不同器官及果实发育阶段呈现差异表达模式。值得注意的是，McYABBY3和McYABBY8在果实成熟过程中持续活跃表达。此外，RT-qPCR分析表明，McYABBY基因家族成员对非生物胁迫表现出差异响应：盐胁迫下6个基因上调、2个下调；PEG诱导的渗透胁迫下5个基因上调、2个下调、1个相对不变。这些发现为苦瓜McYABBY基因的未来功能研究和育种应用奠定了基础。

一、研究背景与意义

YABBY转录因子是植物特有的一类转录因子家族，在叶片近远轴极性建立、营养与生殖生长调控、激素响应、逆境抗性以及次生代谢物生物合成等过程中发挥关键作用。大量证据表明YABBY在果实发育中具有不可或缺的调控功能。在拟南芥中已鉴定出6个YABBY基因，分别在不同发育阶段发挥特定作用；在番茄中，YABBY基因被证实是果实发育的重要调控因子，如SlCRCa通过影响果皮细胞分裂与扩展负调控果实大小，SlYABBY2a在果实隔膜发育中具有特异性功能。在葫芦科作物中，黄瓜CsCRC通过直接靶向并上调生长素响应基因CsARP1，其过表达可使果长增加9%；甜瓜CmYAB2过表达可通过影响细胞分裂和扩展相关基因显著增加果实长度和直径。此外，YABBY基因的表达受干旱、高盐和低温等环境因素影响，在多种作物中被证实参与非生物胁迫响应。

苦瓜是葫芦科苦瓜属的一种热带和亚热带藤本植物，其果实不仅是重要蔬菜，还具有增进食欲、促进消化、心血管保健和抗炎等多种健康功效，是兼具农业和医药价值的多功能药用作物。果实产量和品质是苦瓜重要的经济性状，同时干旱和盐胁迫严重制约葫芦科作物的生产力。然而，苦瓜中YABBY基因此前未见报道。近期苦瓜端粒到端粒（T2T）水平高质量基因组的发布，为系统研究该物种YABBY基因家族提供了契机。本研究通过多种生物信息学方法对苦瓜YABBY基因家族进行了鉴定，并实验检测了不同器官及非生物胁迫下的表达模式，为后续功能研究和分子育种奠定基础。

二、研究内容与主要结论

研究人员利用苦瓜T2T基因组，通过BLAST、HMMER搜索及SMART结构域验证，首次在全基因组水平上鉴定了苦瓜YABBY基因家族，共获得8个成员，命名为McYABBY1至McYABBY8。系统分析了这些基因的序列特征、染色体分布、基因结构、保守基序、蛋白质三维结构、系统发育关系及共线性关系，并通过RNA-seq和RT-qPCR检测了不同器官、果实发育阶段及盐胁迫和PEG诱导渗透胁迫下的表达模式。研究得出以下主要结论：苦瓜YABBY基因家族包含8个成员，分布于5条染色体上，所有蛋白均含典型的C₂C₂锌指结构域和YABBY结构域，亚细胞定位预测均为细胞核；系统发育分析将McYABBYs划分为CRC、FIL/YAB3、YAB2、YAB5和INO五个经典分支，与双子叶植物尤其葫芦科作物亲缘关系更近；共线性分析表明该家族的扩张完全源于片段重复而非串联重复，形成三对旁系同源基因对；表达分析显示McYABBY3和McYABBY8在果实发育全过程中持续高表达，是果实发育调控的候选基因；盐胁迫下6个基因上调、2个下调，PEG渗透胁迫下5个上调、2个下调、1个相对不变，McYABBY8在盐胁迫下表现出强烈的后期累积响应。

三、关键技术与方法

研究人员主要采用了以下关键技术方法：利用苦瓜T2T基因组（品种Y52，数据来源于Bittergourd DB数据库）进行基因家族鉴定，通过BLAST和HMMER搜索结合SMART结构域验证筛选候选基因；使用MEGA12构建基于邻接法（NJ）的系统发育树，Bootstrap值设为1000；利用MCScanX进行种内和种间共线性分析，并用TBtools进行可视化；基于Bittergourd DB数据库的RNA-seq数据提取TPM值进行表达热图分析；通过RT-qPCR对基因表达进行实验验证，以Actin基因作为内参，采用2^?ΔΔCT方法计算相对表达量。植物材料为浙江省金华市农业科学院选育的苦瓜品种‘碧月’，果实样品在授粉后4、7、12、15和18天采集；胁迫处理采用四叶期幼苗，分别用20% PEG-6000溶液进行渗透胁迫处理和205 mM NaCl溶液进行盐胁迫处理，在处理后0、6、12和24小时取样。

四、研究结果

3.1 苦瓜McYABBY基因家族的鉴定

通过以拟南芥YABBY蛋白为查询序列，在苦瓜基因组中共鉴定到8个YABBY同源基因，分布于11条染色体中的5条上，按染色体顺序命名为McYABBY1至McYABBY8。基因组长度范围为1至6 kb，CDS长度范围为510至699 bp，编码169至232个氨基酸的蛋白质，所有McYABBY蛋白均预测定位于细胞核。

3.2 McYABBYs的基因结构与编码蛋白结构

根据蛋白序列相似性，8个McYABBYs可分为四组基因对：McYABBY1/4、McYABBY2/5、McYABBY3/7和McYABBY6/8。所有McYABBY基因均含5至6个内含子。所有McYABBY蛋白均含两个保守基序：N端C₂C₂锌指结构域和C端高度保守的YABBY结构域。McYABBY1/3/4/8蛋白在C端区域还含有额外未知基序。三维结构预测显示McYABBY蛋白主要由随机卷曲组成，其次为α-螺旋和β-转角。

3.3 McYABBYs的共线性和系统发育分析

基于苦瓜、拟南芥、水稻、草莓、石榴、番茄和西瓜共52个YABBY同源蛋白构建的系统发育树显示，这些蛋白可分为五个经典分支：CRC、FIL/YAB3、YAB2、YAB5和INO。所有McYABBYs均归入五个分支，未形成独立分支。其中McYABBY6和McYABBY8分别归入CRC和YAB2分支，McYABBY2/5归入INO分支，McYABBY3/7归入FIL/YAB3分支，McYABBY1/4归入YAB5分支。种内共线性分析发现3对共线性McYABBY基因对，即McYABBY1/4、McYABBY2/5和McYABBY3/7，均位于不同染色体的保守共线性区块中，表明该家族扩张完全源于片段重复。种间共线性分析显示8个McYABBYs与5个拟南芥YABBY基因存在共线性关系，其中McYABBY6和McYABBY8分别与拟南芥CRC和YAB2呈一一对应关系，三对片段重复基因对分别对应拟南芥YAB5、INO和FIL。

3.4 McYABBYs在不同器官中的表达模式

RNA-seq数据分析显示，McYABBY3和McYABBY8在不同器官和果实发育阶段均高表达，而McYABBY2和McYABBY5转录水平极低。McYABBY1、McYABBY4和McYABBY7主要在叶片中中等表达，McYABBY6在花和幼果中表达。RT-qPCR结果独立验证了RNA-seq数据的总体表达趋势，表明McYABBY家族成员在苦瓜不同器官发育过程中存在显著表达分化。

3.5 McYABBYs在盐胁迫和PEG诱导渗透胁迫下的表达模式

盐胁迫下，McYABBY1、McYABBY3、McYABBY5、McYABBY6、McYABBY7和McYABBY8表达被诱导，其中McYABBY1、McYABBY3、McYABBY5和McYABBY7在6小时达到峰值后逐渐下降，McYABBY6和McYABBY8随时间逐渐升高，McYABBY8在24小时时表达量较0小时升高20倍以上；McYABBY2和McYABBY4则被显著抑制。PEG渗透胁迫下，McYABBY1、McYABBY2和McYABBY6呈典型早期应激响应特征，在6小时急剧升高后迅速下降；McYABBY4和McYABBY7随时间逐渐上调；McYABBY3和McYABBY5被显著抑制；McYABBY8在整个处理期间保持相对稳定。

五、讨论与结论

讨论部分指出，苦瓜YABBY基因家族在基因结构和进化关系上高度保守，但表达模式存在明显分化。McYABBY3和McYABBY8的广泛持续表达与其参与基本器官形态建成一致，而McYABBY1、McYABBY4和McYABBY7的叶片特异性表达提示其可能参与叶片发育。McYABBY6在花和幼果中的表达符合YABBY家族成员在生殖器官发育中的普遍作用。McYABBY2和McYABBY5与拟南芥INO共线性，推测其可能在胚珠或珠被中表达或在种子发育特定阶段发挥作用。McYABBY3和McYABBY8在果实发育全过程中持续高表达，与黄瓜、西瓜、菠萝、番茄等物种中功能重要的YABBY成员的表达模式一致，提示其为果实发育调控的候选基因。McYABBY8在盐胁迫下的强后期诱导响应可能不仅源于渗透效应，还可能与盐特异性离子毒性、活性氧稳态或相关激素信号通路有关。研究人员同时指出两项方法学局限：PEG-6000土壤浇灌处理与纯水培体系或自然水分亏缺存在差异，且未监测细胞离子状态，因此结论仅限于分子转录水平。未来将通过转基因手段结合植物水分关系和Na⁺/K⁺离子平衡分析，阐明McYABBY8在苦瓜盐胁迫响应中的作用。

研究结论：本研究首次在苦瓜中通过全基因组鉴定和表达分析系统表征了YABBY转录因子家族，共鉴定到8个McYABBY基因，全面分析了其结构特征、系统发育关系以及在不同器官、果实发育阶段和非生物胁迫条件下的表达分化。McYABBY3和McYABBY8因其在果实发育全过程中的持续高表达被确定为果实发育调控功能研究的候选基因。此外，McYABBY基因家族成员对非生物胁迫表现出差异表达响应。这些结果丰富了葫芦科作物YABBY基因家族进化保守性和功能多样性的认识，为改良苦瓜果实性状和胁迫响应提供了有价值的候选基因资源。