《Biology》：In Vitro Generation of Neural Cells with Regenerative Potential from Seabream Radial Glial Stem Cells: A Preliminary Study
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在海洋硬骨鱼类中，神经毒性和神经病理学研究目前因缺乏经过验证的体外模型而受到限制。尽管斑马鱼胚胎细胞培养为研究控制神经元生长和分化的细胞及生化机制提供了成熟平台，但海洋物种的类似模型仍然稀少。为弥补这一方法学空白，本研究从金头鲷（Sparus aurata）脑
在海洋硬骨鱼类中，神经毒性和神经病理学研究目前因缺乏经过验证的体外模型而受到限制。尽管斑马鱼胚胎细胞培养为研究控制神经元生长和分化的细胞及生化机制提供了成熟平台，但海洋物种的类似模型仍然稀少。为弥补这一方法学空白，本研究从金头鲷（Sparus aurata）脑组织中建立了一种原代神经胶质细胞培养系统，通过表征放射状胶质（radial glial, RG）细胞及其神经元后代的形态学、免疫表型、增殖和迁移特性，来研究中枢神经系统（central nervous system, CNS）的神经发生。该体外模型可能再现天然CNS组织结构，从而能够详细检查神经干细胞分裂方式、干细胞巢动力学以及放射状胶质支架。研究人员的发现表明，金头鲷RG细胞可能充当多能神经干细胞，通过不对称分裂产生幼年神经元，并引导其沿放射状胶质纤维迁移。在RG集落中央区域正在积极进行神经发生的细胞中，PCNA和UCHL1免疫反应性共定位，证实了其活跃的增殖状态。体外培养3周后，集落中央核心保留了驱动持续神经发生的增殖性干细胞巢，而外周区域则由分化的GFAP阳性星形胶质细胞与延伸的神经元突起交织构成。此外，细胞核动力学的延时成像直接可视地证实了神经母细胞沿RG支架的移动，在此过程中迁移中的神经母细胞表现出连续的细胞核扩张和伸长，作为主动运动的结构标志。这些体外增殖动力学与硬骨鱼大脑的永久神经可塑性高度吻合，构成了比较神经生物学和神经毒理学的重要工具，并可能成为中枢神经系统修复模型的有用资源。
海洋硬骨鱼类的神经毒理学和神经病理学研究长期受限于缺乏经过验证的体外模型。尽管斑马鱼（Danio rerio）胚胎细胞培养是研究神经元生长和分化的成熟平台，但海洋物种的类似系统稀少，且斑马鱼脑组织量小，原代细胞产量有限，难以支撑复杂下游实验。为此，研究人员建立了来自金头鲷（Sparus aurata）脑组织的原代神经胶质细胞培养系统，旨在通过表征放射状胶质（radial glial, RG）细胞及其神经元后代的形态学、免疫表型、增殖和迁移特性，研究中枢神经系统（central nervous system, CNS）的神经发生。该体外模型有望再现天然CNS组织结构，为研究神经干细胞分裂方式、干细胞巢动态和RG支架提供平台。研究人员发现金头鲷RG细胞可充当多能神经干细胞，通过不对称分裂产生新生神经元，并引导其沿RG纤维迁移；RG集落中央区增殖细胞共表达PCNA和UCHL1，培养3周后中心仍保留增殖性干细胞巢，外周为GFAP阳性星形胶质细胞与神经元突起交织；延时成像证实神经母细胞沿RG支架迁移时发生细胞核连续扩张与伸长。这些体外动力学与硬骨鱼脑永久神经可塑性一致，为比较神经生物学、神经毒理学及CNS修复研究提供了有价值的模型。
研究人员采用了以下关键技术方法：从商业孵化场获取50尾幼年金头鲷（平均体重35±5 g），无菌取脑，经机械解离和酶消化（胶原酶IV、透明质酶IV-S、分散酶II、DNase I），并用Percoll不连续密度梯度离心纯化神经胶质细胞（平均活力92.8%）。细胞接种于I型胶原包被表面，在添加EGF、氢化可的松、胰岛素、ITS+等的L-15富集分化培养基中长期维持，通过差速振荡去除小胶质细胞和少突胶质细胞。采用免疫荧光标记GFAP、Vimentin、Nestin、β-III-tubulin、MAP2、NeuN、UCHL1、PCNA、CD44等标志物，结合延时成像（每15分钟一次，持续12小时）分析细胞迁移，按轨迹角度区分径向迁移（0°–30°）和切向迁移（60°–90°），并按标准界定有丝分裂胞体移位（mitotic somal translocation, MST）。
研究结果如下：
3.1 形态学特征：接种后24小时神经干细胞呈卵圆形，第2天出现双极或三极形态；培养2周内可区分RG干/祖细胞（RGSPs）、神经干细胞（NSCs）和神经祖细胞（NPCs）三种群体，RGSPs形成高增殖性不规则多边形集落。
3.2 集落形成与增殖巢：培养1周内RG祖细胞向集落周围延伸形成放射状突起，出现生长锥；早期基底RG细胞（bRGCs）快速分裂，形成具有活跃增殖干细胞巢特征的微环境。
3.3 有丝分裂分裂动力学：早期以对称增殖分裂为主以扩大祖细胞池；中间阶段不对称神经源性分裂产生一个祖细胞和一个神经元或中间祖细胞；晚期发生对称胶质源性分裂，产生星形胶质细胞。
3.4 自我更新途径：神经干细胞通过对称自我更新和不对称自我更新维持储备；bRGC对称分裂后远端子核向生长中突起移位，不对称分裂则产生较小的基底子细胞，进而形成迁移性神经母细胞。
3.5 放射状和切向迁移机制：放射状迁移依赖RG纤维作为物理支架，细胞核沿纤维方向持续延长；切向迁移则横向越过相邻纤维，利用轴突或胶质突起作轨道，细胞核形态变化较不规则。
3.6 细胞骨架动力学与MST：延时成像显示bRGPC在分裂前发生MST，核向纤维远端移动，随后子核沿纤维返回；中心体位于核前方，细胞后部收缩蛋白积累驱动核移位；核伸长是穿越致密环境的必要机械适应。
3.7 长期神经元成熟和星形胶质细胞支架：神经元在4–6天开始发出神经突，2周后分支增多；富集分化培养基中星形胶质细胞形成成熟单层并持续产生神经元；神经突长度和分支在2个月时达峰。
3.8 表型特征和标记物表达：RG细胞同时表达GFAP和Vimentin，1个月龄集落核心表达Nestin；成熟星形胶质细胞表达CD44+和GFAP+；神经元表达β-III-tubulin、MAP2、NF和NeuN；2个月后集落中心仍有UCHL1+/PCNA+增殖性神经祖细胞，外周为分化神经元和胶质。
3.9 神经巢结构与RG集落：PCNA+复制细胞集中于集落中心，外周为GFAP+星形胶质细胞与MAP2+神经元突起交织；UCHL1+新生神经元沿RG纤维迁移；β-III-tubulin标记显示神经元胞体膨大和中心体/微管组织中心（MTOC）前移，表明处于迁移准备状态。
讨论部分指出，该研究证实RG细胞是金头鲷脑内主要的成体神经干细胞，其分裂模式与哺乳动物胚胎RG相似，但在成体中持续存在。培养中的RG通过对称和不对称分裂维持神经发生并重建支架。该模型可用于比较神经生物学、神经毒理学、药物筛选和CNS修复机制研究。研究人员同时承认当前局限包括物种特异性抗体缺乏、体外模型不能完全模拟体内微环境，以及需要更多标准化纵向研究以探索移植应用。
结论翻译：总之，本研究建立了一个充分表征的金头鲷中枢神经系统体外模型，证明其RG细胞作为多能、自我更新的神经干细胞，具有高神经再生潜力。形态学和免疫细胞化学分析描绘了硬骨鱼神经源性巢的结构组织，并绘制了RG祖细胞持续产生神经元和胶质谱系路径。通过追踪活细胞核动力学和细胞移位，研究人员提供了沿初级放射状支架的独特高效神经元迁移模式的直接证据。RG纤维的动态结构作为结构支架，积极支持持续神经元生长。这些细胞作为神经祖细胞的主要储存库，赋予神经组织特殊结构和细胞可塑性与再生能力。该模型是CNS修复的关键比较框架，并为药理学、毒理学、生理学、病毒学、神经病理学和海洋神经免疫学等领域的筛选应用提供了易获取的资源。
