基于计算虚拟筛选鉴定迷迭香酸作为PI3Kα变构位点的天然产物结合物

《Biology》：In Silico Identification of Rosmarinic Acid as a Putative Natural Product Binder of the PI3Kα Allosteric Site

　　

PIK3CA突变通过激活磷脂酰肌醇3-激酶α（PI3Kα）驱动肿瘤发生。变构抑制剂STX-478对PI3Kα表现出高选择性，并可避免高血糖等不良反应。高血糖是ATP竞争性PI3Kα抑制剂临床应用受限的主要原因。迄今为止，尚无变构PI3Kα抑制剂获批用于临床。因此，开发新型变构PI3Kα抑制剂为携带PIK3CA突变的患者提供了一种有前景的治疗策略。本研究建立了一个用于发现经计算优先排序的变构PI3Kα抑制剂候选物的流程，整合了虚拟筛选、多平台成药性评估、分子动力学模拟以及代谢途径与代谢物分析。研究人员利用虚拟筛选，基于STX-478与PI3Kα的结合模式，从小分子库中识别出经计算优先排序的变构PI3Kα抑制剂候选物，并进一步筛选出具有良好类药性质的化合物。通过分子动力学模拟评估这些候选物与蛋白的结合稳定性。此外，还表征了命中化合物的代谢特征。迷迭香酸（一种咖啡酸和3,4-二羟基苯基乳酸的酯类化合物）被筛选为经计算优先排序的变构PI3Kα抑制剂候选物。迷迭香酸与PI3Kα复合物的CDOCKER能量（-69.4529 kcal/mol）低于STX-478（-66.7128 kcal/mol）。分子动力学模拟显示，迷迭香酸能够稳定地与PI3Kα结合。ADMET预测表明，迷迭香酸具有良好的安全性特征和可接受的药代动力学性质。本研究为筛选潜在的变构PI3Kα抑制剂候选物奠定了计算基础。

研究背景、现存问题与研究目的

磷脂酰肌醇3-激酶α（PI3Kα）是一种脂质激酶，由催化亚基p110α和调节亚基p85α组成，在细胞生长、增殖和存活中发挥关键作用。PIK3CA基因编码p110α亚基，其突变（尤其是螺旋结构域的E542K/E545K和激酶结构域的H1047R热点突变）会导致PI3Kα异常激活，驱动头颈癌、子宫内膜癌、胃癌、结直肠癌等多种实体瘤的发生与发展。目前已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准的PI3Kα抑制剂均为ATP竞争性抑制剂，如Alpelisib和Inavolisib。然而，由于PI3K家族各亚型ATP结合位点高度同源，此类抑制剂易产生脱靶效应，导致浓度依赖性的严重不良反应，其中高血糖是最常见的副作用，严重影响患者依从性和治疗效果。相比之下，变构抑制剂STX-478和RLY-2608通过结合PI3Kα变构位点实现高选择性抑制，可避免代谢功能障碍，已在临床试验中展现出良好的抗肿瘤活性和安全性。然而，截至目前尚无变构PI3Kα抑制剂获得FDA批准上市。因此，开发新型PI3Kα变构抑制剂是癌症治疗的新方向。天然产物具有结构多样性和低毒性等优势，约30%市售药物来源于植物提取物或微生物代谢物，已成为创新药物研发的重要来源。基于此，本研究旨在通过建立一套综合的计算筛选平台，从天然产物小分子库中快速识别靶向PI3Kα变构口袋的候选配体。

研究方法

研究人员采用了一套多阶段集成的计算筛选工作流程。首先，基于STX-478与PI3Kα变构位点（蛋白质数据库编号PDB ID: 8TGD）的结合模式，利用Discovery Studio 3.5中的LibDock模块对包含11898个小分子的内部化合物库进行高通量虚拟筛选，选取排名前96的化合物。随后，采用CDOCKER方法对这些化合物进行精确重对接，以CDOCKER能量作为评分标准。其次，利用ADMETlab 3.0、SwissADME和ProTox 3.0等多个在线平台对候选化合物进行全面的吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADMET）性质预测及类药性评估。再次，使用GROMACS 2020.3软件包，分别应用amber99sb-ildn力场和通用琥珀酸力场（GAFF）对蛋白和配体进行参数化，对PI3Kα-迷迭香酸复合物体系开展100纳秒的分子动力学（MD）模拟，并通过分子力学泊松-玻尔兹曼表面积法（MMPBSA）计算结合自由能。最后，利用GLORYx在线平台预测迷迭香酸的代谢途径和下游代谢产物。

研究结果

PIK3CA与肿瘤的相关性分析： 利用GeneCards数据库分析发现，PIK3CA基因与子宫内膜癌（相关性评分20.91）、结直肠癌（50.87）、头颈部鳞状细胞癌（9.23）和乳腺癌（73.08）均显示出显著的临床相关性。

虚拟筛选与分子对接： 通过LibDock初筛获得96个候选化合物（LibDock评分≥144.486）。CDOCKER重对接结果显示，迷迭香酸的CDOCKER能量（-69.4529 kcal/mol）低于阳性对照STX-478（-66.7128 kcal/mol），表明其与PI3Kα变构口袋具有更强的结合亲和力。分子间相互作用分析表明，迷迭香酸可与变构口袋内的多个关键残基形成氢键，包括GLN809、LEU911、LYS941、ARG949、GLU950、ILE1019和ILE1022，其中与LEU911和LYS941的相互作用模式与STX-478相似。

成药性评估： 利平斯基五规则（Lipinski's Rule of Five）评估显示，迷迭香酸符合所有五项规则。ADMET预测结果表明，迷迭香酸的血浆蛋白结合率（PPB）为77.3%（中等结合），血浆清除率（CL）为13.238 mL/min/kg（中等清除），半衰期（T_1/2）为1.906小时（短半衰期），生物利用度评分为0.56，皮肤渗透系数Log Kp为-6.82 cm/s。迷迭香酸对多种细胞色素P450（CYP450）酶（CYP3A4、CYP1A2等）无抑制作用，且不太可能是P-糖蛋白（Pgp）抑制剂。毒性预测显示，其半数致死剂量（LD₅₀）为5000 mg/kg（低毒），且具有较低的肝毒性、神经毒性、呼吸毒性、心脏毒性、致癌性、致突变性和细胞毒性风险。

分子动力学模拟： 经过100纳秒的模拟，PI3Kα和PI3Kα-迷迭香酸复合物的均方根偏差（RMSD）分别在20纳秒后达到平衡，平均值分别为0.247±0.005 nm和0.255±0.001 nm，表明体系达到稳定的构象平衡。复合物的均方根涨落（RMSF）值（0.108±0.010 nm）低于单独PI3Kα（0.119±0.008 nm），提示迷迭香酸结合增强了蛋白的结构稳定性。溶剂可及表面积（SASA）和回旋半径（Rg）的轻微下降进一步支持了配体结合使蛋白构象更紧凑的观点。MMPBSA计算的结合自由能为-29.763±5.691 kJ/mol，表明复合物形成在热力学上有利。氢键分析显示平均氢键数为3.971±1.612，证实了稳定的氢键接触。残基能量贡献分析确定了LYS941、LYS942、LYS943、LYS948、ARG949、ARG951、ILE1019、ILE1022、ARG1023和LYS1024为核心相互作用残基。

代谢谱预测： 迷迭香酸可能经历I相和II相代谢转化，主要包括硫酸化、O-葡萄糖醛酸化、甲基化、芳香族羟基化和芳香族脱羟基化等途径，共生成41种代谢产物。其中6种代谢产物的优先级评分高于0.8，主要通过硫酸化和O-葡萄糖醛酸化途径产生。

结论与讨论

本研究成功建立了一个基于计算机辅助筛选的PI3Kα变构抑制剂发现平台，通过整合分子对接、多维ADMET预测和分子动力学模拟技术，从天然产物小分子库中系统筛选并获得了靶向PI3Kα变构口袋的预测配体迷迭香酸。迷迭香酸作为一种天然酚酸化合物，其苯环上的羟基可与变构位点的GLN809、GLU950、ARG949和LYS941形成氢键，羰基可与LYS941形成氢键，羧基可与ILE1022、ILE1019和LEU911形成氢键。该化合物具有良好的安全性和可接受的预测药代动力学性质。迷迭香酸经历以硫酸化和O-葡萄糖醛酸化为主的广泛II相结合反应，这一过程可能降低母体化合物的全身暴露量。其结构中多个可电离的酚羟基和一个羧酸基团降低了膜通透性，进一步限制了口服吸收。由于硫酸化/葡萄糖醛酸化会显著改变分子性质，推测结合型代谢产物可能失去对PI3Kα的强结合亲和力。因此，迷迭香酸更适合被视为一个有吸引力的起始骨架，可能需要通过结构修饰来克服通透性差和广泛代谢的问题。本研究仅限于计算预测，缺乏生物学实验验证，迷迭香酸的激酶抑制效力、亚型选择性和细胞活性尚未确定，后续需要通过体外和体内实验验证其是否通过特异性结合PI3Kα变构口袋发挥抗肿瘤活性，并应通过X射线共晶结构测定来实验验证预测的变构结合模式和分子间相互作用。